WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 |

Продемонстрированная сайт-специфичность в отношении основного белка мие лина и его презентированных пептидов позволяет вплотную подойти к созданию тест-систем на основе сконструированных модельных субстратов.

4. ПОЛУЧЕНИЕ КАТАЛИТИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ, РАСЩЕПЛЯЮЩИХ ПОВЕРХНОСТНЫЙ ГЛИКОПРОТЕИН ВИЧ-1 GPСоздание протеазы, способной узнавать и гидролизовать избранный белковый эпитоп, является одной из фундаментальных проблем современной биохимии и молекулярной биологии. В качестве белка-мишени в настоящей работе был выбран поверхностный гликопротеин gp120 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), являющийся основным антигеном вируса и ключевым участником системы подавления вирусом иммунного ответа реципиента (Poignard, Saphire et al. 2001). Выбор объекта обусловлен безуспешностью попыток нейтрализовать ВИЧ in vivo антителами, полученными непосредственно иммунизацией животных поверхностными антигенами и их аналогами (Burton 1997; Tang, Kuhen et al. 1999; Burton and Parren 2000), что является следствием гипервариабельности иммунодоминантных областей gp120 и маскирования константных частей белка в результате тримеризации gp120 и экранирования многочисленными N-связанными олигосахаридными группами (Pollard, Meier et al. 1991; Blankson, Persaud et al. 2002). Расщепление gp120 в организме пациента по специфическим сайтам позволит преодолеть иммунологическую мимикрию вируса, нарушить упаковку поверхностного антигена, экспонировать его константные эпитопы и обеспечить возможность элиминации или эффективного сдерживания инфекции ВИЧ иммунной системой пациента.

Как уже отмечалось выше, природные протеолитические антитела часто обнаруживались при аутоиммунных патологиях. Одновременно с этим было показано, что при иммунизации аналогом переходного состояния реакции гидролиза сложных эфиров (фосфонатом) мышей линий SJL и MRL/lpr, склонных к аутоиммунным патологиям, частота появления гидролитических абзимов значительно выше, чем в случае контрольной линии Balb/c (Tawfik, Chap et al. 1995).

На основании всего вышесказанного для получения антител, расщепляющих gp120, было предложено использовать два различных подхода: «реакционную иммунизацию» и индукцию антиген-специфического каталитического ответа на фоне аутоиммунного процесса.

4.1. Индукция эпитоп-специфического каталитического ответа методом «реакционной иммунизации».

Суть метода «реакционной иммунизации» заключается в индукции антител, которые в отличие от «традиционных» связываются с гаптеном ковалентно.

Образование ковалентного интермедиата с фторпроизводными фосфонатов было показано для каталитических эстеролитических антител 17Е8 (Zhou, Guo et al. 1994; Guo, Huang et al. 1995) и 9А8 (Kolesnikov, Kozyr et al. 2000). Эти факты позволяют предположить, что ковалентный каталитический аппарат сериновых гидролаз в абзимах может быть воспроизведен. Для получения специфического абзима методом реакционной иммунизации необходимо, чтобы гаптен представлял собой структуру, «голова» которой содержит механизм-зависимый ингибитор протеазы, а «хвост» – пептидильную цепь, соответствующую по длине участку, взаимодействующему в активном центре фермента.

В качестве полипептидной цепи была выбрана небольшая последовательность Leu-Ala-Glu-Glu-Glu-Val, соответствующая аминокислотным остаткам 265-270 гликопротеина вируса иммунодефицита человека 1 (ВИЧ-1) – gp120.

Ранее было показано (Pollard, Meier et al. 1991), что специфичное расщепление по этому сайту приводит к тому, что gp120 теряет свою способность связываться с рецептором CD4, что не позволяет вирусу инфицировать CD4+ клетки.

Данный пептид был модифицирован по С-концевой аминокислоте группой механизм-зависимого ингибитора – дифенил фосфонатом. Такой пептид относится к пептидил -аминоалкилфосфонатам. Схема его синтеза и структура представлены на рис. 27. Необходимо отметить, что важным свойством выбранного гаптена является низкая неспецифическая реакционная способность и высокая стабильность в водных растворах.

Рис. 27. Схема синтеза пептидил фосфоната – LAEEEV-Phos.

Поскольку известно, что малые молекулы, в большинстве случаев, являются слабыми иммуногенами, для проведения эффективной иммунизации синтезированные реакционные пептиды были конъюгированы с KLH. Для присоеди нения N-концевой аминогруппы пептида к доступным аминогруппам KLH был выбран метод с предварительной 3 активацией носителя при помощи бис[сулфосукцинимидилсуберата] (BS, Pierce) и последующим присоединением гаптена. Для эффективной детекции каталитических антител N-конец синтезированного пептидил фосфоната был модифицирован активированным эфиром биотина.

Для получения эпитопспецифических абзимов использовали три линии мышей: MRL/lpr, NZB/NZW F1 и SJL – являющихся моделями различных аутоиммунных заболеваний. Иммунизацию мышей данных линий проРис. 28. Иммуноферментный анализ сывороток крови иммунизированных мышей. Адсорбцию про- водили по ранее опублиководили в лунках с иммобилизованными антигенаванной схеме получения ми. Комплекс детектировали при помощи антивикаталитических антител к довых антител, конъюгированных с пероксидазой хрена.

аналогам переходного состояния ферментативных реакций (Tawfik, Chap et al. 1995). Сравнительный анализ специфического иммунного ответа на антиген у разных иммунизированных мышей всех трех линий (рис. 28) проводили методом иммуноферментного анализа (ELISA). В качестве антигена был использован исходный пептидилфосфонат, меченный биотином; биотинилированный Val-фосфонат и нитрофенилметил-пбиотинилфенилметил фосфонат (Bt-Y), для которого ранее была показана специфическая ковалентная модификация активного центра абзимов (Kolesnikov, Kozyr et al. 2000). Для всех трех линий иммунизированных мышей оказалось, что антитела обладают высокой специфичностью к модифицированному пептидному фрагменту антигена, не взаимодействуют в условиях данного эксперимента со свободным Val-фосфонатом, и, в то же время, связываются с более активным и менее специфичным модифицирующим агентом - Bt-Y.

Дальнейшее изучение типа взаимодействия полученных антител с реакционным пептидом проводилось на аффинно-очищенных препаратах IgG. Иммобилизованный на мембране ковалентный комплекс антиген–антитело детекти ровали методом иммуноблоттинга. Результаты данного эксперимента (рис. 29) свидетельствуют о наличии в препаратах поликлональных антител, выделенных из аутоиммунных мышей, иммунизированных «реакционным» пептидом LAEEEV-Phos, как легких, так и тяжелых цепей иммуноглобулинов, способных к ковалентной модификации пептидом.

Т.е. в результате реакционной иммунизации образовались антитела, способные ковалентно взаимодействовать с гаптеном и строго Рис. 29. Электрофореграмма и иммуноблоттинг поликлональных анспецифичные тител (1 мкг), выделенных из иммунизированных мышей линий SJL, MRL и NZB/NZW F1 после реакции с пептидил фосфонатом - LAEEEVк его пептидPhos (0,1 мкМ). Трипсин (1 мкг), БСА (5 мкг) и поликлональные IgG, ной комповыделенные из мыши линии BALB/c (1 мкг), были использованы в качестве положительного и отрицательного контролей, соответст- ненте.

венно.

В результате скрининга панели гибридом, полученных из селезенок опытных мышей, были отобраны 7 моноклональных антител, способных к ковалентной модификации реакционным пептидил фосфонатом. Причем в двух случаях модификации подвергались легкие цепи антител, а в пяти – тяжелые.

ДНК, соответствующая вариабельным доменам данных антител, была наработана методом ПЦР, и определена нуклеотидная последовательность. Одноцепочечные антитела были экспрессированны в прокариотической системе. Рекомбинантные антитела Е11 и Е6 обладали каталитической активностью по отношению к низкомолекулярному субстрату LAEEEV-MCA. Кинетические па-3 -раметры гидролиза амидной связи составили: kcat = 1,1 ± 0,5 x 10 min, Km = -4 -53 ±14 мкM для антитела Е6 и kcat =3,2 ± 0,7 x 10 min, Km = 48 ±11 мкM для антитела Е11.

Проведенные эксперименты показали принципиальную возможность по лучения специфичных к антигену каталитических антител методом реакционной иммунизации.

4.2. Получение каталитических антител, специфичных к gp120, на фоне индуцированного аутоиммунного заболевания.

Для целей настоящего исследования была выбрана линия мышей SJL, развивающая ЕАЕ при иммунизации иммунодоминантным пептидом ОБМ 85-97 (Sakai, Zamvil et al. 1988; Tan, Kennedy et al. 1992).

Была разработана оригинальная схема индукции антиген-специфического протеолитического иммунного ответа при иммунизации животных слитным белком, состоящим из константных областей gp120 и пептида ОБМ 85-101.

Получение слитных белков для иммунизации и изучения свойств антител Исходя из опубликованных исследований по структуре, иммуногенности и функциональной активности gp120 (Hansen, Lund et al. 1996; Shioda, Oka et al. 1997;

Sullivan, Sun et al. 1998) были определены участки белка с относительно константной последовательностью. Для дальнейшего использования был выбран химерный полипептид, состоящий из трех фрагментов gp120 (аббревиатуры I, II, III) c делецией первого, второго и третьего гипервариабельных регионов и окружающих их гидрофобных альфа-спиральных участков 1, 2; также был удален лидерный пептид gp120 и С-концевой альфа-спиральный участок 6. В качестве исходной матрицы для получения “минимального” белка была использована последовательность гена HXB2-env, соответстующий клон был предоставлен AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, NIH.

Был получен набор генетических конструкций, кодирующих выбранные фрагменты gp120, тиоредоксин I E.coli, гексагистидиновые кластеры, эпитоп человеческого белка р62c-myc и пептид ОБМ 85-101, в различных комбинациях (рис. 30).

Для экспрессии рекомбинантных белков был выбран штамм E.coli BL21(DE3). Полипептиды trx, и 1-3 выделяли методом металло-хелатной хроматографии в нативных условиях, тогда как для продуктов конструкций 4-использовали денатурирующие условия. Полученные белки были охарактеризованы масс-спектрометрически.

Для исследования сайт-специфичности протеолитических антител была также получена растворимая форма белка trx-gp120I-III при экспрессии в штамме E.coli Origami B (DE3), с последующей преципитацией белка сульфатом аммония, металло-хелатной хроматографией и анионообменной хроматографей.

Рис. 30. Схема участков экспрессионных конструкций, кодирующих рекомбинантные белки. Названия рекомбинантных белков приведены справа, номера конструкций – слева.

Поскольку нативный gp120 содержит 22-24 N-связанные олигосахаридные группы (Yeh, Seals et al. 1993), гликозилированный полноразмерный gp120 для целей настоящего исследования был получен в бакуловирусной системе экспресии.

Были использованы вектор pMelBacB и фрагмент гена env из плазмиды HXB2-env, соответствующий зрелому gp120. Целевой белок был выделен из супернатанта культуры и очищен до гомогенности по ДСН-ПААГ. Идентичность очищенного gp120 была подтверждена N-концевым секвенированием и энзиматическим Nдегликозилированием; электрофоретическая подвижность дегликозилированного gp120 соответствовала теоретической массе (56 кДа). Таким образом, был получен набор рекомбинантных белков, достаточный для иммунизации животных, изучения параметров иммунного ответа и характеризации каталитических антител.

Индукция экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита у мышей.

Индукция ЕАЕ у мышей линии SJL была проведена при помощи слитного белка gp120I-IIImbp или пептида ОБМ85-97 в соответствии со стандартным протоколом (Miller and Karpus 1996). Распределение мышей по опытным и контрольным группам приведено в таб. 6.

Развитие ЕАЕ у мышей, иммунизированных gp120I-IIImbp или пептидом ОБМ85-97, было дополнительно исследовано путем гистологического анализа, проведенного через 30 дней после начала иммунизации. На срезах тканей были зафиксированы изменения, типичные для развивающегося ЕАЕ (Schwartz 1993), что показывает возможность индукции ЕАЕ пептидом ОБМ85-101 в составе слитного белка.

Группа животных SJL-1 SJL-2 SJL-3 SJL-4 SJL-5 SJL-6 Balb-1 Balb-Пептид gp120IИммуноген - ОБМ Gp120I-IIImbp gp120I-III IIImbp 85-Доза, мкг - 170 150 300 150 300 - trx-gp120I-III - - + + + + - + trx- gp120I-II - - + + + + - + trx- gp120III - - + + + + - + trx-mbp - + + + - - - + ОБМ85-97 – БСА - + + + - - - + Trx - - - - - - - - Таб. 6. Специфический иммунный ответ мышей линии SJL, по данным ИФА. Результат ИФА считали положительным, если для всех мышей из исследуемой группы величина сигнала в три и более раз превышала фоновое значение. Разведение исследуемых сывороток при анализе варьировалось для разных антигенов. Все группы состояли из 5 мышей.

Каталитические свойства полученных антител Исследование протеолитических свойств антител иммунизированных мышей проводилось с помощью ранее разработанного флуоресцентного теста. В качестве специфического субстрата использовался gp120I-III, избыточно меченый флюоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ). Как видно из Рис. 32, при иммунизации мышей слитным белком gp120I-III-mbp происходит значительное увеличение протеолитической активности антител по отношению к антигену, достигающее 9-ти раз при иммунизации gp120I-III-mbp в дозе 150 мкг/мышь, по сравнению с контролями.

Уменьшение активности антител в случае иммунизации gp120I-III-mbp в дозе мкг/мышь, может быть объяснено более интенсивным маскированием субстрата связывающими антителами. Также следует отметить, что уровень протеолитической активности антител по отношению к неспецифическому субстрату ФИТЦ-БСА практически одинаков для иммунизированных и интактных мышей SJL Рис. 32. Протеолитическая активность антител.

Увеличение интенсивности флюоресценции gp120I(данные не приводятся).

III-ФИТЦ при распаде субстрата. Относительное Установление сайтувеличение интенсивности флюоресценции вычислено как отношение разности интенсивности флюо- специфичности протеолиресценции в момент времени t (Ft) и интенсивности тических антител к gpфлюоресценции в момент начала реакции (F0) к инСпецифичность протеолиза, тенсивности флюоресценции в момент начала реакции (F0): A=(Ft-F0)/F0. Приведены средние значения катализируемого исследуемыми для трех независимых измерений и стандартное отантителами, была исследована клонение.

Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»