WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |

Таким образом, охарактеризованные аутоиммунные линии мышей MRLlpr/lpr, SJL/J и NZB/NZW F1 являются перспективной моделью для направленного получения и изучения специфических абзимов с различной активностью.

3.2. Каталитические аутоантитела при рассеянном склерозе.

Механизмы развития системных аутоиммунных заболеваний, а также этиологические факторы, приводящие к возникновению этих нарушений, сегодня остаются неясными. При этом патологическая роль аутоантител в разрушении тканей и клеточных структур не вызывает сомнений. Среди заболеваний аутоиммунной природы рассеянный склероз (РС) представляет собой серьезную медицинскую и социальную проблему. Факторы, приводящие к массовой демиелинизации нервных волокон при данном заболевании, неизвестны. Одна из наиболее обоснованных теорий патогенеза отводит основную роль в разрушении миелина воспалительному процессу, связанному с аутоиммунными реакциями. В этой связи нами была высказана гипотеза о роли каталитической функции аутоантител в протеолитическом расщеплении компонентов миелиновой оболочки. На предварительном этапе настоящего исследования был проведен анализ неспецифической протеолитической активности антител, выделенных из сывороток крови больных РС. Для детекции абзиматической активности был использован разработанный ранее флуоресцентный тест. Тестирование сывороток на наличие специфических аутоантител к ОБМ проводили с помощью иммуноферментного анализа (ELISA). Анализ полученных данных выявил высокую корреляцию (р<0.001) между концентрацией аутоантител и наличием протеолитической активности в препаратах антител у больных РС.

Таким образом, безусловный интерес представляло определение каталитической активности фракции аутоантител к ОБМ по отношению к антигену у больных РС и модельных животных. Индукцию ЕАЕ у мышей линии SJL проводили по классической схеме двукратной иммунизацией ОБМ.

Выделение поликлональных Рис. 17. Электрофореграмма (А, Б, Г) и иммуноблот (В) образцов IgG из сывороток гидролиза ОБМ (А), БСА (В) и МОГ (Г) препаратами антител, полученными из сывороток крови больных РС (А, Г) и мышей линии крови пациентов с SJL c индуцированным EAE (Б, В). Показана протеолитическая акРС и мышей литивность суммарного пула иммуноглобулинов класса G (IgG фракнии SJL с ЕАЕ ция), а также сорбирующихся (IgG ОБМ+) и не сорбирующихся (IgG ОБМ-) на иммобилизованный ОБМ антител. Легкие и тяжелые осуществляли цепи антител обозначены Lc и Hc соответственно.

хроматографией на колонке HiTrap Protein-G Sepharose (Amersham), дальнейшее получение ОБМ-связывающих антител проводили методом аффинной хроматографии с использованием в качестве сорбента иммобилизованного на сефарозе основного белка миелина.

Активность полученных препаратов антител была охарактеризована по реакциям протеолиза с использованием неспецифических (биотинилированный бычий сывороточный альбумин, миелин-олигодендроцитарный гликопротеин (МОГ), тиоредоксин I E. сoli) и специфического (основной белок миелина) субстратов. Результаты, представленные на рис. 17, свидетельствуют о том, что препараты антител, выделенных из сывороток больных рассеянным склероРис. 18. Электрофореграммы гидролиза ОБМ препаратами зом и модельных антител, полученными из сывороток крови больных РС, помышей линии SJL с сле выделения методом гель-фильтрации в денатурирующих условиях (A, Б) и адсорбции (В) с антителами против иммуиндуцированным ноглобулинов человека (-h) и мыши (-m). На профиле EAE, обладали катаэлюции обозначены анализируемые фракции, соответствующие 150 кДа.

литической активностью только в отношении основного белка миелина. Контрольные антитела из пулированной сыворотки здоровых доноров проявляли фоновый уровень активности ко всем описанным субстратам.

Подтверждение «абзиматического» характера обнаруженной активности и отсутствия вклада в эту активность сопутствующих Рис.19. Электрофореграмма гидролиза ОБМ Fab ферментативных примесей было фрагментами антител, полученных из сывороток крови больных РС (А). Зиммограмма сорбируюполучено методами гельщихся (ОБМ+) и не сорбирующихся (ОБМ-) на фильтрации (рис.18) в денатурииммобилизованный ОБМ IgG антител (Б). Белки рующих условиях (6М мочевина разделялись в 5-20% ПААГ в присутствии флуоресцентного субстрата БСА-ФИТЦ, внесенного в или буфер Gly-HCl, pH 2.6) и зигель при полимеризации. Трипсин в количестве мографии (рис. 19б). Выделенные 10 пг и 30 пг использовался в качестве положительного контроля.

Fab фрагменты антител также обладали гидролизующей активностью по отношению к ОБМ (рис.19а). Кроме того, обнаруженная активность исчезала после прединкубации с иммобилизованными антивидовыми антителами (рис. 18).

При сравнительном анализе протеолитической активности аутоантител, для 24 пациентов с различными стадиями РС была выявлена корреляция между уровнем каталитической активности аутоантител и глубиной развития патологического процесса РС согласно общепринятой шкале EDSS (expended disability status scale). Кроме того, обнаруженная активность ингибировалась копаксоном (Copaxone), известным лекарственным средством при РС, представляющим собой сополимер лизина, глутаминовой кислоты, аланина и тирозина.

Методами иммуногистохимии удалось показать взаимодействие ОБМРис.20. Иммунодетекция взаимодействия ОБМ-специфичных антител с миелиновыми структурами мозга. (А) Иммуноблот: ОБМ (m), гомогенат мозга крысы (h), указаны антитела, использованные для детекции. (Б) Схема среза мозга крысы. (В) Окрашивание миелина по Райту. Г-Е – двойное окрашивание: (Г) –MAт382 (Alexa 546, красный), (Д) – антитела пациента с РС (FITC, зеленый), (Е) – колокализация Г и Д, (Ж-З) – окрашивание на серийных срезах: (Ж) – MAт382 (Alexa 546, красный), (З) – IgG антитела мыши с ЕАЕ (Alexa 488, зеленый).

специфичных абзимов с миелином на нативных срезах мозга и колокализовать их с моноклональным антителом к ОБМ МАт 382, что свидетельствует о потенциальной возможности взаимодействия ОБМ-абзимов с миелиновыми структурами мозга (рис.20).

Определение сайт-специфичности гидролиза основного белка миелина аутоантителами.

Для определения сайт-специфичности гидролиза ОБМ аутоантителами было применено сочетание методов обращенно-фазовой хроматографии, трицинового белкового электрофореза и масспектрометрии SELDI. На первом этапе продукты гидролиза были разделены с использованием обращенно-фазовой хроматографии на колонке C4 (Рис. 21А). Далее, образцы фракций анализировали с использованием трицинового электрофореза, с последующей детекцией Рис. 21. Обращенно-фазовая хроматография продуктов гидролиза ОБМ аутоантителами (А) и анализ образцов посредством трицинового электрофореза (Б): 1 - интактный ОБМ, 2-8 - фракции, полученные при разделении продуктов гидролиза на обращенной фазе, 9 - гидролизат без разделения; показаны идентифицированные фрагменты. (В) основные сайты гидролиза ОБМ специфическими аутоантителами (красные стрелки). Желтым отмечены иммунодоминатные районы белка, оранжевым обозначен энцефалитогенный пептид.

низкомолекулярных пептидов при помощи флуоресцентного красителя Sypro Orange (Рис. 21Б), и SELDI-масспектрометрии.

В результате удалось идентифицировать каждый фрагмент в структуре основного белка миелина и показать присутствие шести основных сайтов гидролиза ОБМ специфическими аутоантителами (Рис. 21В). Пять из них расположены в иммунодоминантных районах ОБМ, опознаваемых молекулами главного комплекса гистосовместимости II класса, ассоциированными с рассеянным склерозом, а два - локализованы на энцефалитогенном пептиде – индукторе EAE у модельных животных.

Исследование субстратной специфичности анти-ОБМ аутоантител на модельных пептидах.

Дальнейшее исследование специфичности аутоантител проводили с помощью сконструированной «эпитопной библиотеки» перекрывающихся пептиРис. 22. (А) Схема плазмидного вектора, сконструированного для экспрессии слитного белка тиоредоксина I E. сoli c фрагментами основного белка миелина. (Б) Аминокислотная последовательность ОБМ человека. Показано распределение пептидов на последовательности основного белка миелина.

дов в составе слитных белков с тиоредоксином, соответствующей полной последовательности ОБМ. Этот подход был выбран на основании концепции предпочтительного «представления» субстратных пептидов в растворе в составе биополимера. Для изучения протеолиза изолированных эпитопов ОБМ специфичными антителами на основе экспрессионного вектора pET-32b-CH(+) были созданы двенадцать генно-инженерных конструкций, содержащих последовательности, кодирующие различные фрагменты основного белка миелина человека (Рис. 22). Между тиоредоксином и последовательностью пептидов основного белка миелина был помещен линкер (SGGGG)3S, для придания гибкости и подвижности конструируемым рекомбинантным белкам. Наличие подобного пептидного линкера содействует корректной презентации фрагментов ОБМ в составе фьюжн-белка с тиоредоксином.

Фрагменты ДНК, кодирующие данные пептиды (ОБМ1-12) и серинглициновый линкер (Link), были наработаны методом ПЦР с использованием перекрывающихся специфических олигонуклеотидных праймеров, содержащих дополнительно сайты рестрикции (Рис. 23). Затем полученные ПЦР продукты пептидов ОБМ были рестрицированы эндонуклеазой BamHI и лигированы с рестрицированным BglII линкером, с одновременной рестрикцией BamHI и BglII для удаления из реакционной смеси нецелевых продуктов лигирования. Лигазная смесь была использована для амплификации фрагментов Link-ОБМ методом ПЦР с использованием концевых специфических олигонуклеотидных праймеров.

Наработанный таким образом фрагмент ДНК был рестрицирован эндонуклеазами PciI и BclI и лигирован в NcoI-BamHI рестрицированный вектор pET-32b-CH(+). Полученным лигатом трансформировали клетки E.

coli штамма DH5.

Экспрессию проводили в клетках E. coli штамма BL21(DE3) в стандартных условиях. Поскольку все рекомбинантные белки содержат Рис. 23. Схема получения экспрессионного вектора pET-32b-ОБМпептид-CH(+), содер- (His)6 кластеры, их выделение из жащего фрагменты 1-12 ОБМ клеточных лизатов проводилось с применением металл-хелатной хроматографии. Дальнейшая очистка велась на ионообменной смоле MonoS с последующей гель-фильтрацией на колонке Superdex75. Гомогенность полученных препаратов контролировалась электрофорезом с окрашиванием Кумасси и иммуноблоттингом с использованием моноклональных антител к c-myc эпитопу и составляла более 95%.

Для характеристики субстратной специфичности антител, фьюжнбелки тиоредоксина с фрагментами ОБМ инкубировались с иммуноглобулинами (суммарная IgG фракция), изолированными из сыворотки крови 26 больных рассеянным склерозом, пациентов с другими нейродегенеративными заболеваниями (OND), здоровых доноров (HD) и мышей аутоиммунной линии SJL с ЕАЕ. Как видно из приведенных электрофореграмм (Рис. 24), в случае пациентов с РС и остеохондрозом протеолизу подвергались только пептиды, содержащие энцефалитогенную последовательность ОБМ. С другой стороны у мышей SJL c EAE, предрасположенных к развитию аутоиммунных заболеваний, наблюдался множественный гидролиз перекрывающихся эпитопов ОБМ. Каталитические свойства проявили антитела, изолированные из 77% пациентов с прогрессирующим и 85% с ремитирующим типом течения РС. Среди больных с OND и здоровых Рис. 24. Сверху - вниз: Контроль; гидролиз модельных пептидов антителами, изолиродоноров каталитического ответа не ванными из пациента с РС, остеохондронаблюдалось, за исключением двух зом, мышей линии SJL с ЕАЕ;трипсином, каслучаев остеохондроза, при которых тепсином D и ММР 3.

было отмечено наличие каталитической деградации пептида ОБМ под действием аутоантител. Причем эти больные характеризовались значительной длительностью патологического процесса и серьезными нейрональными поражениями.

Контроль специфичности гидролиза осуществлялся разрезанием рекомбинантных белков трипсином, катепсином D и металлопротеазой матрикса 3 (MMP-3) (Рис. 24).

Для всех исследованных антител методом масспектрометрии SELDI сайты гидролиза были локализованы исключительно в рекомбинантных фрагментах ОБМ (Рис. 25), и повторяют таковые в нативном белке. При детальном анализе продуктов расщепления энцефалитогенного пептида антителами было обнаруРис. 25. Последовательности пептидных фрагментов ОБМ человека. Сайты гидролиза рекомбинантных фрагментов антителами, изолированными из пациентов с рассеянным склерозом, обозначены красным; из мышей линии SJL с EAE - отмечены белым.

жено, что сайтами гидролиза являются как Lys91 так и Arg97, причем лишь у двух пациентов степень расщепления по двум приведенным сайтам оказалась сравнимой. В большинстве случаев при РС наиболее предпочтительным для гидролиза являлся аргининовый сайт, и антитела, специфичные к участку ОБМ81-103, составляют подавляющее большинство в общем пуле ОБМ-гидролизующих иммуноглобулинов. Полученные результаты хорошо согласуются с литературными данными относительно В-клеток, изолированных из больных РС, и узнающих преимущественно данный эпитоп, а также - с фактом значительной иммунодоминантности этого фрагмента при представлении молекулами главного комплекса гистосовместимости II класса патогенных T-клеток.

Специфичность гидролиза ОБМ аутоантителами позволила разработать «модельный субстрат» для анализа сывороток больных РС и скрининга гибридом, продуцирующих моноклональные каталитические антитела к ОБМ. Для этого на основе вектора pQЕ30 была создана генно-инженерная конструкция, экспрессирующая два флуоресцентных белка PS-CFP2 и TurboYF, соединенные пептидом ОБМ81-103, содержащим энцефалитогенную последовательность, - Рис. 26. (А) Принципиальная схема FRET-подхода к исследованию кинетики абзиматической реакции. (Б,В) Расщепление белка EPeFRET абзимами и модельными протеазами соответственно. Во врезке показано изменение спектра флуоресценции во времени.

так называемый «EPeFRET» - от Encephalitogenic Peptide Fluorescence Resonance Enegy Transfer (Рис. 26А). При разрезании линкера прекращается резонансный перенос энергии и происходит падение флуоресценции (Рис. 26Б, В).

Были получены кинетические константы гидролиза EPeFRET аутоантителами и ингибирование данной реакции слитными белками и копаксоном.

Можно предположить, что достаточно медленное, но направленное действие антител по протеолизу ОБМ возможно играет определенную роль в разрушении миелиновых структур и патогенезе рассеянного склероза. Нами показано, что каталитическая активность аутоантител по отношению к ОБМ и его фрагментам выделяет рассеянный склероз в сравнении с другими нейродегенеративными заболеваниями значительно больше, чем связывание с данным антигеном.

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»