WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 6 |

Детекция протеолитической активности абзима проводилась при помощи метода, основанного на разгорании флуоресценции при протеолитическом расщеплении белка, избыточно меченного флуорофорной группой. Прохождение реакции детектировалось по разгоранию флуоресценции во времени по сравнению с контролем. Субстратом реакции являлся бычий сывороточный альбумин, избыточно меченный флуоресцеинизотиоцианатом (БСА-ФИТЦ). В качестве модельной протеазы для определения кинетических параметров данного метода использовался трипсин. Протеолитическая активность Рис. 8. Гидролиз субстрата БСА-ФИТЦ полнаблюдалась как в случае полноноразмерным антиидиотипическим антитеразмерного антитела 6B8-E12, так и лом 6B8-E12 (черный) и его Fabфрагментом (серый). Антитело 4H7-H3 исв случае его Fab-фрагмента, в то пользовалось в качестве отрицательного время как увеличение флуоресценконтроля.

ции в случае амидазного антитела 4H7-H3, гидролизующего suc-AAPFpNa, сводилась к фоновым значениям (Рис.

8). Кроме того, было показано, что антитело 6B8-E12, также как и субтилизин, способно специфически расщеплять РНКазу А.

Эндопротеиназная активность антитела 6B8-E12 уменьшалась при добавлении в реакционную смесь апротинина и, практически, сводилась до фоновых значений при действии классического ингибитора сериновых протеаз - PMSF, что предполагает участие в катализе нуклеофильного аминокислотного остатка (Рис. 9а). Кроме того, протеолитическое расщепление БСА-ФИТЦ абзимом ин а б Рис. 9. Ингибирование гидролиза БСА-ФИТЦ антителом 6B8-E12. 0,16 мкМ БСА-ФИТЦ инкубировалась: а - с 0,5 мкМ абзима (), в присутствии 1 мкМ апротинина () или мкМ PMSF (). б – с 1 мкМ 6B8-E12 в присутствии антитела 5-H4 (концентрация 5-Hизменялась от 0 до 3 мкМ). Относительная активность рассчитывалась как отношение скорости гидролиза субстрата в присутствии 5-H4 к скорости гидролиза БСА-ФИТЦ в отсутствии идиотипа.

гибировалось в присутствии идиотипического антитела 5-H4 (Рис. 9б). Полученные результаты свидетельствуют о том, что каталитическая активность связана с антителом, и активный центр находится в антигенсвязывающем центре.

Альтернативное подтверждение «абзиматического» характера обнаруженной активности и отсутствия вклада в эту активность сопутствующих ферментативных примесей было получено методом зимографии. Анализ зимограммы (Рис. 10) показывает наличие протеолитической активности только у белков с Mw150 кДа (дорожки 2,3), в то время как флюоресценция контрольных антител (дорожка 1) отсутствует.

Для исследования специфичности полученного антиидиотипическоРис. 10. Зимограмма препарата антитела 6B8-E12. 100 нг (дорожка 2) и 200 нг го каталитического антитела был про(дорожка 3) белка разделялось в 10% веден масс-спектрометрический анаПААГ в присутствии флуоресцентного лиз продуктов протеолиза некоторых субстрата БСА-ФИТЦ, внесенного в гель при полимеризации. Трипсин в количеприродных биоактивных пептидов стве 100 пг (дорожка 4) и 1 нг (дорожка (Рис. 11). Приведенные данные сви5). Mab к с-Myc эпитопу (200 нг) (дорожка 1).

детельствуют о том, что большинство исследованных пептидных субстратов имеют сайты расщепления, содержащие ароматические и алифатические аминокислотРис. 11. Гидролиз биоактивных пептидов антителом 6B8-E12.

ные остатки до Гидролизуемая связь указана черной стрелкой для антитела, красной – для фермента; ароматические аминокислотные остатки или после сай(прямоугольник), алифатические аминокислотные остатки (круг).

та, что в некоПродукты гидролиза детектировались масс-спектрометрически.

торой степени соответствует субстратной специфичности «родительского антигена» - субтилизина Карлсберг.

2.2. Структурный анализ вариабельных доменов моноклональных антител 5-H4 и 6B8-E12.

Для изучения структурных особенностей антител и экспрессии абзима в гетерологичной системе вариабельные домены легких и тяжелых цепей данных антител были клонированы и определена их нуклеотидная последовательность.

В качестве источника мРНК для клонирования генов вариабельных доменов моноклональных антител 5-H4 и 6B8-E12 использовались соответствующие гибридомы. Наработка кДНК и амплификация генов вариабельных областей тяжелых и легких цепей (FvH и FvL) проводилась методом одностадийного RТ ПЦР. Амплификация вариабельных доменов легкой цепи (VL) проводилась с использованием прямых вырожденных нуклеотидных праймеров, соответствующих N-концевым последовательностям легких цепей мышиных антител, и обратных вырожденных праймеров, соответствующих J-фрагментам мышиных антител. Вариабельные домены тяжелой цепи (VH) амплифицировали при помощи набора прямых вырожденных праймеров, созданных на основе основных лидерных последовательностей тяжелых цепей антител мыши, и обратных праймеров для J-фрагментов. Очищенные ПЦР-продукты, соответствующие по размеру VL- и VH-фрагментам, были лигированы в плазмиду pGEM5Zf(+), обработанную рестриктазой EcoRV. Полученными лигатами трансформировали клетки E. coli штамма DH5. Для положительных клонов была определена нуклеотидная последовательность цепей ДНК и предсказана первичная структура, соответствующая FvH и FvL районам иммуноглобулинов.

Сравнение аминокислотных последовательностей антитела 5-H4 с опубликованными ранее (Protein Data Bank) показало высокую степень сходства с антителами – ингибиторами ферментов: с легкой цепью антитела F11.2.32, полученного против протеазы ВИЧ 1, и легкой цепью антитела 2b-2F; которое ингибирует рибонуклеазную активность ангиогенина, реагируя с его ключевыми каталитическими остатками. Антитело F11.2.32 имеет интересную структурную особенность: CDR1 легкой цепи образует «выпячивание», формируя подобие «пальца», который предположительно входит в активный сайт при связывании с протеазой ВИЧ 1.

Компьютерная трехмерная модель одноцепочечного антитела 5-H4 (Рис.12) была построена с использованием программного обеспечения Insight II на основе двух структурных моделей из Protein Data Bank с высокой VH+VL гомологией: 1dzb (анти-лизоцим scFv 1F9) и 1jp5 (scFv фрагмент антитела 1696 против протеазы ВИЧ 1).

Анализ 3D-модели антитела 5-HРис. 12. Трехмерная модель вариабельного показал наличие плоской поверхфрагмента идиотипического антитела 5-H4.

ности, образованной тяжелой цеЗаметны, характерные выступающая часть легкой цепи (1) и плоский участок тяжелой пью, что характерно для белокцепи (2) связывающих антител, и наличие выступающей вперед легкой цепи, которая, возможно, взаимодействует с активным центром субтилизина.

Для создания 3D-модели одноцепочечного антитела 6B8-E12 в качестве матрицы использовалась последовательность 1qok (scFv против антикарциноэмбрионального антигена). При анализе этой модели было также установлено наличие плоской поверхности, типичной для белок- и пептид-связывающих ан тител, и широкой «щели» между VH и VL CDR участками с высокой концентрацией гидрофобных аминокислотных остатков, что, возможно, и определяет алифатическую и ароматическую специфичность абзима 6B8-E12.

(Рис. 13) 2.3. Экспрессия рекомбинантного антитела 6B8E12 в виде одноцепочечного антитела.

Генетическую конструкцию для экспрессии рекомбинантного одноцепочечного антитела создавали по следующей схеме (Рис.

Рис. 13. Трехмерная модель вариабельного 14) фрагмента антиидиотипического антитела На основании полученных 6B8-E12. Стрелками указана щель между вариабельными доменами легкой и тяжелой цеданных по определению нуклеопей.

тидной последовательности антитела 6B8-E12 были созданы праймеры соответствующие N-концевым последовательностям (11, 12) и J-фрагментам (13, 14) легких и тяжелых цепей. Для клонирования в соответствующий вектор данные праймеры содержали необходимые сайты для эндонуклеаз рестрикции. Гибкий серин-глициновый линкер ((Ser-Gly4)3) был создан на основе праймеров 15-17. Линкер соединяли с вариабельным доменом легкой цепи с использованием сайтов PciI и NcoI, соответственно. Полученный фрагмент (линкер-VL) был амплифицирован с использованием праймеров 15 и 13 и лигирован с VH последовательностью при помощи XhoI и SalI сайтов рестрикции.

Конечный фрагмент, содержащий полную последовательность одноцепочечного антитела, был амплифицирован с использованием праймеров 12 и 13, рестрицирован эндонуклеазами NcoI и NotI и клонирован по соответствующим сайтам в плазмидный вектор pET22N, созданный на основе вектора pET22b(+) и содержащий NcoI рестриктный сайт в последовательности периплазматического лидера. Дополнительный фрагмент, содержащий последовательности, кодирующие эпитоп с-myc и шестигистидиновый кластер, был клонирован в конечную конcтрукцию по сайтам BglII и NotI (Рис. 14Б).

Для экспрессии рекомбинантных белков был выбран штамм E.coli Рис. 14. Схема создания генетической конструкции для экспрессии рекомбинантного антитела 6B8-E12 в виде одноцепочечного антитела.

BL21(DE3). Для scFv были подобраны условия культивирования, приводящие к появлению максимально возможного количества целевого белка в растворимой форме. Одноцепочечное антитело выделяли в нативных условиях методом металло-хелатной хроматографии с использованием сорбента Co2+-TALON. Дополнительная очистка была проведена с помощью ионообменной хроматографии на колонке MonoQ (Amersham). Экспрессированный белок также был дополнительно охарактеризован с помощью масс-спектрометрии продуктов его трипсинолиза. Полученные результаты свидетельствуют о соответствии экспериментально полученного белка его теоретической пептидной карте.

2.4. Исследование каталитических свойств полученного одноцепочечного антитела.

Полученное рекомбинантное антитело проявляло заметную амидазную активность (Рис. 15) по отношению к метилкумариламидным (MCA) субстратам, содержащим алифатические (Met-MCA, LeuMCA) и ароматические (Phe-MCA) аминокислотные остатки, что соответствует данным по субстратРис. 15. Гидролиз MCA-пептидов (50 мкМ) рекомбиной специфичности исход- нантным scFv6B8-E12 (0,75 мкМ). () – Met-MCA, () – Leu-MCA, () – Phe-MCA, () – буфер PBS ного антиидиотипического антитела 6B8-E12.

Кинетика данных реакций подчинялась уравнению Михаэлиса-Ментен, что позволило рассчитать их кинетические параметры (Таб. 5). При этом не удалось зарегистрировать сколько-нибудь значительную протеолитическую активность по отношению к БСА-ФИТЦ.

Таким образом, рекомбинантное одноцепочечное антитело, в общих чертах, сохранило функцию исходного моноклонального антитела, что свидетельствует в пользу Таб. 5. Кинетические параметры для реакций «абзиматической» природы амидолиза рекомбинантным scFv 6B8-E12.

обнаруженной активности.

Отсутствие активности по отношению к высокомолекулярному субстрату может быть обусловлено структурными особенностями рекомбинантного антитела – наличием междоменного гибкого линкера, затрудняющего правильный фолдинг продукта. По всей видимости, полученный «минимальный катализатор», не способен осуществить в полной мере сложную протеолитическую функцию, присущую полноразмерному антителу.

3. КАТАЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ АНТИТЕЛ ПРИ АУТОИММУННЫХ ПАТОЛОГИЯХ.

Спонтанная индукция каталитических антител при ряде аутоиммунных нарушений, таких как системная красная волчанка (СКВ), ревматоидный артрит, склеродермия, аутоиммунный миокардит и др. является сегодня неопро вержимым фактом. Протеолитическая деградация белковых антигенов абзимами описана для тироглобулина при аутоиммунном тироидите, вазоактивного интестинального пептида у больных бронхиальной астмой, фактора VIII свертывания крови у больных гемофилией А. Показана протеолитическая активность белка Бенс-Джонса. Однако, вопрос о функциональной роли абзимов при аутоиммунных патологиях, путях и закономерностях их появления остается открытым и требует дальнейшего изучения.

3.1. Каталитическая активность нативных антител у мышей с аутоиммунными нарушениями.

Инбредные линии мышей с аутоиммунными заболеваниями являются моделью для изучения многих аспектов аутоиммунности. У мышей линии MRLlpr/lpr, дефицитных по FAS, с возрастом возникают аутоиммунные нарушения, во многом сходные с СКВ и ревматоидным артритом. Новозеландские гибриды NZB/NZW F1 спонтанно развивают СКВ-подобный нефрит. Линия SJL/J характеризуется целым рядом индуцируемых аутоиммунных нарушений, в том числе развитием экспериментального аллергического энцефаломиелита (ЕАЕ) – модели рассеянного склероза. Таким образом, исследование природного спектра каталитических антител, образующихся у этих мышей, представляет безусловный интерес. В данной работе впервые был проведен сравнительный анализ каталитической активности антител у аутоиммунных мышей линий MRL-lpr/lpr, SJL/J и NZB/NZW F1 по отношению к линии BALB/c. Активность выделенных препаратов поликлональных IgG антител была охарактеризована по трём реакциям (ДНК-гидролиз, протеолиз, эстеролиз), для которых ранее была показана возможность катализа абзимами.

Протеолитическая активность в препаратах антител детектировалясь двумя различными методами: флуоресцентным и энзиматическим. В флуоресцентном тесте в качестве субстрата для протеолиза использовался бычий сывороточный альбумин, избыточно меченный флуоресцеинизотиоцианатом (БСАФИТЦ).

Кроме того, для изучения кинетических параметров реакции расщепления белков абзимами был разработан альтернативный, принципиально новый способ - энзиматический тест. Принцип данного метода, основан на использовании в качестве субстрата малых количеств высокоактивного фермента - рибонуклеазы А, что позволяет достичь значительного молярного избытка фермента над субстратом и, таким образом, приблизить условия изучаемой реакции про теолиза к таковым для стандартной модели нестационарной кинетики (S0<

На рис. 16 представлены результаты тестирования протеолитической активности в препаратах антител, выделенных из мышей линий MRL-lpr/lpr, SJL/J, NZB/NZW F1 и BALB/c. Полученные в ходе исследований результаты свидетельствуют о наличие природных антител с различной каталитической активностью у мышей, характеризующихся как спонтанно возникающими, так и индуцируемыми аутоиммунными заболеваниями.

Рис. 16. Определение протеолитической активности препаратов антител, выделенных из мышей линий BALB/c, NZB/NZW F1, MRL-lpr/lpr, SJL/J, флуоресцентным методом(а) и энзиматическим методом(б). а - 1 мкг БСА-ФИТЦ инкубировали с 5мкг очищенных IgG в течение 24 и 48 часов. Изменение флуоресценции определяли в % по отношению к контролю (1 мкг БСА-ФИТЦ), инкубированному в тех же условиях. б - РНКазу А в концентрации 11 нM инкубировали с очищенными IgG в концентрации 3.мкM в течение 17 и 32 часов. Степень гидролиза РНКазы определяли в % как отношение измеренной рибонуклеолитической активности к таковой в начальный момент времени.

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 6 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»