WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 6 |

Для селекции активных фаговых антител, способных ковалентно взаимодействовать с Bt-X, была использована стандартная схема, с некоторыми модификациями. Реакцию фаговых частиц с биотинилированным фосфонатом проводили в растворе. Для достижения специфичности реакции варьировали о о концентрацию Bt-X (от 40 до 1 мкМ) и температуру реакции (22 С и 37 С). Избыток Bt-X удаляли двукратным переосаждением фаговых частиц раствором ПЭГ/NaCl. Для предотвращения неспецифической сорбции использовали кислый Трис-глициновый буфер (рН 2,7). Элюцию фаговых частиц проводили раствором трипсина.

По описанной выше схеме были проведены три раунда селекции. После третьего раунда селекции поликлональные одноцепочечные антитела (ScFv) были проэкспрессированы в клетках HB2151. Растворимые ScFv были выделены из периплазматической фракции методом металло-хелатной хроматографии с использованием сорбента Ni-NTA. Полученные рекомбинантные антитела были использованы для реакции с Bt-X.

Продукты реакции разделяли в полиакриламидном геле (ПААГ) и детектировали методом иммуноблоттинга с использованием стрепРис. 3. Иммунодетекция поликлональных ScFv после реакции с Bt-X, методом тавидина, коньюгированного с пеиммуноблоттинга. На ПААГ наносили белки, роксидазой хрена. Наличие рекомвыделенные из: десяти пулированных клонов, отобранных после третьего раунда се- бинантных ScFv, контролировали лекции (1); общего пула клонов, отобранных гибридизацией с моноклональныпосле третьего (2) и второго (3) раундов семи антителами к шестигистидинолекции; неселектированной библиотеки Griffin.1 (5). 4 – контрольное рекомбинантное вому эпитопу (рис. 3).

антитело к тиреоглобулину; 6 - 0,1 мкг трипПолученные результаты посина. Детекцию осуществляли с использовазволили сделать вывод о том, что нием стрептавидина или моноклональных антител к 6xHis эпитопу, конъюгированных с селекция прошла успешно, и полипероксидазой хрена.

клональные антитела, полученные после третьего раунда, способны ковалентно взаимодействовать с Bt-X фосфонатом. Девяносто шесть клонов после третьего раунда селекции были выбраны для дальнейшего изучения. Клоны, показавшие в ПЦР анализе наличие полноразмерного фрагмента одноцепочечных антител, были использованы для экспрессии. Периплазматическая фракция была выделена для каждого индивидуального клона и использована в реакции с Bt-X фосфонатом.

Реакционные смеси были проанализированы методом иммуноблоттинга, как описано выше.

Одиннадцать эффективно экспрессирующихся ScFv были отбраны на основании специфического мечения полосы в области 28 кДа (обозначены «А»). Семь рекомбинантных анРис. 4. Иммуноферментный анализ тител, не способных к ковалентной ScFv, после реакции с Bt-X. Адсорбцию ScFv проводили в лунках с иммобилизомодификации (обозначены «S»), но ванными анти c-myc антителами. Компоказавших хороший уровень эксплекс ScFv-Bt-X детектировали при попрессии, были выделены и, после рекмощи стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена. S.1, S.3, S.7, S.9, ции с биотинилированным фосфонаS.11, S.14, S.17 - рекомбинантные антитом, использованы для иммунофертела, отобранные после третьего раунментного анализа методом ELISA. да, неспособные ковалентно взаимодействовать с Bt-X. N - ScFv из неселектиСвязывание с антигеном оценивали по рованной библиотеки, anti-TyrFv - односравнению с антителом из неселектицепочечное антитело к тиреоглобулину, Bt-X - биотинилированный фосфонат, рованной библиотеки, антителом, свяинкубированный с реакционным буфезывающем тиреоглобулин, и двумя ром. A.5 и A.17 - ScFv, отобранные поантителами, способными взаимодей- сле третьего раунда и взаимодействующие с фосфонатом ковалентно.

ствовать с Bt-X ковалентно. Данные ИФАВприведены трех раундов селекции из библиотеки были отобраны хорошо результатена рисунке 4.

экспрессирующиеся растворимые одноцепочечные антитела, способные взаимодействовать с Bt-X фосфонатом либо ковалентно, либо нековалентно.

1.2. Структурно-функциональный анализ рекомбинантных одноцепочечных антител.

Нуклеотидная последовательность была определена для всех отобранных ScFv. На основании сравнения их первичных последовательностей были выделены 8 (из 11) уникальных «реакционных» клонов (способных взаимодействовать с Bt-X ковалентно) и 6 (из 7) связывающих клонов. Зародышевые линии и семейства тяжелых и легких цепей всех отобранных антител приведены в таблице 1.

Интересно отметить, что легкие цепи всех отобранных ScFv, как связывающих, так и реакционных, за исключением S.9, принадлежат к V1 семейству, причем DPL-3 сегмент является наиболее распространенным. Среди связыТаблица 1. CDR3 последовательности, сегменты и семейства зародышевых линий отобранных клонов.

* AAWDDSL, GTWDSSL, NSRDSSG Указанные последовательности не варьировались в библиотеке Griffin.1.

вающих клонов встречаются VH1, VH4 и VH3 семейства тяжелых цепей, однако для реакционных клонов основным семейством является VH4 (только A.относится к VH1 семейству). Таким образом, для связывания с Bt-X фосфона том необходимо наличие либо V1 DPL3, либо VH4 DP-67 сегментов антител, тогда как для ковалентного взаимодействия предпочтительной является комбинация DPL3 сегмента и VH4 семейства, исключения составляют только A.17 и A.21. Третий гипервариабельный регион тяжелых цепей реакционных клонов имеет некий консервативный консенсус, а последовательность FGGQQVP встречается в двух различных клонах, что может свидетельствовать о непосредственном участии данного фрагмента в «ковалентном катализе».

В таблице 2 приведены кинетические характеристики реакции взаимодействия с фосфонатом Х для всех реакционных ScFv. Можно заметить, что для Таблица 2. Кинетические параметры реакции ScFv с фосфонатом Х. большинства антител кинетические параметры варьируются в очень узком диапазоне. Однако антитело А.17 оказалось практически на порядок более -реакционно-способным (k2=0,32 мин ). Согласно ранее опубликованным данным значения констант скорости реакции для бутирилхолинэстеразы, химот-1 - рипсина и трипсина с фосфонатом Х составляли 1800; 2600 и 4100 М мин, соответственно (Tramontano, Ivanov et al. 2000). Т.е., наиболее активное антитело А.17 обладает реакционной способностью, сравнимой с таковой для природных сериновых гидролаз.

Реакция А.17 с Bt-X фосфонатом ингибировалась прединкубацией с ингибиторами сериновых протеаз, такими как: аминоэтилбензенсульфонил фторид (AEBSF) и аналоги валина и фенилаланина, карбоксильная группа которых заменена на дифенил фосфонат. В то же время прединкубация с более активными фтор фосфонатами, такими как: зарин и кумаринил этил п-трифтор ацетамидофенилметил фосфонат, - не приводила к ингибированию реакции модификации А.17 Bt-X (рис. 5). Полученные данные свидетельствуют о специфичности активного центра, отобранного в результате селекции на Bt-X фосфонат.

Наличие ковалентного взаимодействия между фосфонатом и антителами было подтверждено при помощи прямого метода масс-спектрометрии SELDI. В результате реакции одноцепочечных антител с биотинилированным фосфонатом происходит увеличение массы антител, соответствующее ровно одному остатку Bt-X (646 Да).

Для определения нуклеофильного остатка, участвующего в ковалентном катализе, антитело А.17 было промодифицировано Bt-X, Рис. 5. Иммунодетекция реакций подвергнуто исчерпывающему трипсинолизу, антитела А.17 с механизмзависимыми ингибиторами серии триптический гидролизат был проанализиновых протеаз. А.17 (1 мкМ) инрован методом масс-спектрометрии SELDI в кубировали 1ч на 37оС с 5мМ сравнении с контролем (рис. 6). Было обнаAEBSF (1), 5мМ валил фосфоната (2), 5мМ фенилаланин фосфоната ружено, что модификации подвергается пеп(3), с 100 мкМ зарина (4), тид 152 – 180 одноцепочечного антитела:

мкМ кумаринил этил пVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPK трифторацетамидофенилметилфосфоната (5), 100 мкМ Х (6) и в (таб. 3). Данный пептид соответствует первоотсутствии ингибитора (7). Затем му гипервариабельному региону легкой цепи все образцы инкубировали 1ч при 37оС со 100 мкМ Bt-Х, разделяли в и фланкирующим его первому и второму карПААГ. Детекцию осуществляли касным участкам.

методом иммуноблоттинга с исМодифицированный пептид был дополпользованием стрептавидина, конъюгированного с пероксиданительно очищен методом аффинной хромазой хрена.

тографии с использованием стрептавидин- сефарозы и подвергнут тандемной масс-спектрометрии. МС/МС анализ показал, что ковалентной модификации подвергается Tyr36 легкой цепи, расположенТаблица 3.

*Цистеины, выделенные жирным шрифтом, образуют дисульфидную связь.

** приведены средние молекулярные массы.

Рис. 6. SELDI масс-спектр триптического гидролизата одноцепочечного антитела А.17 (верхняя панель) и антитела А.17, модифицированного Bt-X фосфонатом (нижняя панель).

ный во втором каркасном регионе легкой цепи.

Аналогичным образом для других антител, было показано, что в «ковалентном катализе» принимает участие Tyr32, расположенный в первом гипервариабельном регионе легкой цепи. Интересно отметить, что тирозины 32 и являются весьма консервативными аминокислотными остатками в белках иммуноглобулиновой природы.

Одним из преимуществ работы с рекомбинантными антителами является возможность быстрого осуществления сайт-направленного мутагенеза. Для подтверждения масс-спектрометрических данных тирозины 32 и 36 легкой цепи А.17 и А.5 были заменены на фенилаланин, что не должно было сказаться на структуре антител, но могло кардинальным образом повлиять на их каталитические свойства. Кроме того, тирозин 36 антитела А.17 был заменен на серин. Антитела А.17 и А.5 и их мутанты были проэкспрессированы и выделены методом металл-хелатной хроматографии. Полученные препараты были использованы в реакции с Bt-X фосфонатом. В качестве отрицательного контроля использовалось одноцепочечное антитело к тиреоглобулину. Детекцию протекания реакции вели методом иммуноблоттинга (рис. 7). Замена тирозина 32 на фенилала нин приводит к полной потере активности по отношению к Bt-X в случае антитела А.5, однако это практически не влияет на активность антитела А.17. При этом, замена тирозина 36 на фенилаланин приводит к прямо противоположному результату: мутанты А.17Y36F и A.17Y32,36F оказываются неактивными в реакции с фосфонатом. Неактивным оказался также и мутант A.17Y36S, содержащий замену тирозина 36 на серин. Таким образом, результаты мутагенеза двух «реакционных» антител полностью подтвердили масс-спектрометрические исследования. Было также показано, что в случае антитела А.17 важно не только наличие аминокислотного остатка, содержащего гидроксильную группу в положении легкой цепи, но и расположение этой гидроксильной группы в активном Рис. 7. Иммунодетекция антител А.17, А.5 и их мутанцентре.

тов после взаимодействия с Bt-X. Комплекс детектироА.17, как наиболее вали стрептавидином, конъюгированным с пероксидазой хрена (верхняя панель) и моноклональными антиреакционно-способный, телами к c-myc эпитопу (нижняя панель).

был проверен на амидазную активность на небольшой библиотеке метилкумарин амидных субстратов.

После трехстадийной хроматографической очистки одноцепочечное антитело катализировало гидролиз двух гидрофобных субстратов: Phe-MCA и Boc-AlaAla-Phe-MCA. Амидазная активность отсутствовала в препарате мутированного антитела A.17Y36F, ингибировалась в результате прединкубации А.17 с фосфонатом X и исчезала в результате иммуноадсорбции антителами к с-myc эпитопу, иммобилизованными на агарозу. Гидролиз субстрата Phe-MCA, рекомбинантным одноцепочечным антителом А.17 -подчиняется кинетической схеме -Михаэлиса-Ментен (kcat = 2,1 ± 0,8 x 10 min, Km = 47 ±12 мкM).

В данном исследовании химическая селекция была применена для поиска белковых молекул, проявляющих ковалентную реакционную способность - химическую особенность, являющуюся универсальной для катализа. Одноцепочечные антитела, полученные в этой работе, могут быть рассмотрены как пример простейшего устройства активного центра ферментов и использованы в ка честве матрицы для получения новых искусственных ферментов методом целенаправленного улучшения их свойств (directed enzyme evolution).

2. АНТИИДИОТИПИЧЕСКОЕ АНТИТЕЛО С ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ ФУНКЦИЕЙ.

Данная часть работы проводилась в кооперации с коллегами из лаборатории инженерии ферментов технологического университета Компьена (Франция). Идиотипическое моноклональное антитело 5-H4, полученное при иммунизации мышей линии Balb/c субтилизином Карлсберг, обладало способностью связываться с активным центром фермента и специфически ингибировало его протеолитическую активность. Антиидиотипические антитела были получены при иммунизации мышей линии Balb/c антителом 5-H4. На первом этапе исследований методом иммуноферментного анализа (ELISA) было отобрано несколько десятков моноклональных антител, узнающих вариабельный фрагмент идиотипа 5-H4. На следующей стадии антитела, выделенные из соответствующих клонов, были протестированы на способность гидролизовать хромогенные субстраты субтилизина suc-AAPFpNa и suc-GGLpNa. Из всей панели проанализированных клонов антитело 6B8-E12 наиболее эффективно катализировало гидролиз обоих субстратов и было выбрано для дальнейших исследований.

2.1. Исследование каталитической активности антиидиотипического антитела 6B8-E12.

Для изучения протеолитической активности антитела были предварительно очищены методами аффинной хроматографии с использованием протеин G-сефарозы и аффинного сорбента – иммобилизованных на сефарозе антител козы к иммуноглобулинам мыши, а также ионообменной хроматографии и гель-фильтрации.

Таб. 4. Кинетические параметры для реакций амидолиза и эстеролиза субтилизи ном Карлсберг и антителом 6B8-E12.

Полученные данные по гидролизу низкомолекулярных субстратов sucAAPFpNa и suc-GGLpNa и эстеролизу п-нитрофенилацетата приведены в Таб. 4.

Оказалось, что каталитическая эффективность (kкат/KМ) в реакции с sucAAPFpNa и для субтилизина и для антитела выше, чем для реакции sucGGLpNa, что предполагает сходную субстратную специфичность между ферментом и антителом. В случае п-нитрофенилацетата каталитическая эффективность абзима и фермента сравнима, что можно объяснить слабой эстеролитической активностью субтилизина.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 6 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»