WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Рисунок 9. Изображение двухклеточного эмбриона мыши после его трехмерной реконструкции по серии оптических срезов, полученной посредством количественной микротомографии. Показан эмбрион после 15 минут инкубации в обычной среде Дульбекко, содержащей 140 мМ NaCl; бл - бластомер, пт - полярное тельце, с – складки на поверхности клетки, V - объем бластомера.

Видно (рис. 9), что при инкубации в растворе Дульбекко на одном из бластомеров появляются складки – морфологический признак, который характерен для гипертонических условий (рис. 1Б). Таким образом, сестринские клетки могут поразному реагировать на слабый гиперосмотический стресс, вызванный обычным раствором Дульбекко. Со временем сжатие эмбриональной клетки в «нормальном» растворе Дульбекко, содержащим 140 мМ соли NaCl, компенсируется транспортом основных неорганических ионов (К+, Na+, Cl-) и органических молекул (Pierce, Politis, 1990; Hoffmann, Dunham, 1995). Такой осмотический ответ характеризуют термином «regulatory volume increase» (RVI).

Отметим, что даже кратковременное сжатие эмбриона повышает активность белка p38 MAPK (Fong et al., 2007) и вызывает нарушение развития эмбриона (Van Winkle et al., 1990; Biggers et al., 1993). Внутриклеточный гомеостаз, установившийся de novo в результате компенсаторной реакции RVI на гиперосмотическое действие обычной среды Дульбекко, является существенным фактором, модифицирующим состояние клетки. Например, в результате изменения цитоплазматического Na+/K+ баланса происходит рекомбинация ДНК (Parkinson et al., 2002), экспрессия генов (Taurin et al., 2002), деполимеризация актина (Goldmann, 2003).

Осмотическая реакция эмбриона на гипертонические условия В данной главе обсуждаются результаты изучения действия гипертонических условий на двухклеточный эмбрион мыши. На рисунке 10 показана характерная форма осмотического ответа бластомера на гиперосмотичсекий стресс.

Рисунок 10. Характерная кривая изменения объема бластомера двухклеточного эмбриона мыши в гиперосмотических условиях, моделируемых увеличением в растворе Дульбекко концентрации (мМ) соли NaCl. За начальную точку (контроль) принят объем клетки сразу после выделения эмбриона из яйцевода.

Указаны средние значения и разброс (стандартная ошибка среднего), * -- P < 0.05 по сравнению с контролем (критерий Стюдента, t-test).

В гиперосмотических условиях клетка раннего эмбриона ведет себя как осмометр (рис. 10). В первые минуты стресса объем бластомера уменьшается, достигая равновесного состояния, и клетка остается сжатой в течение всего воздействия.

Другими словами, в данной ситуации не включаются адаптивные механизмы (RVI), направленные на компенсацию гиперосмотического сжатия зародыша. RVI ответ показан нами только для слабовыраженного гиперосмотического действия, вызванного обычным раствором Дульбекко.

Причины аномального поведения эмбриона при гипотоническом стрессе В литературе широко обсуждают механизмы регуляции объема дифференцированных клеток (Macknight, Leaf, 1977; Macknight, 1988; Lang et al., 1998b; Hoffmann et al., 2009). Полагают, что в этом случае основной вклад в адаптацию клетки к осмотическому стрессу вносят мембранные механизмы транспорта ионов и органических молекул (Sarkadi, Parker, 1991; Hoffmann, Dunham, 1995; Baltz, Tartia, 2009). Для раннего эмбриона млекопитающих нет данных по изучению ответа эмбриональной клетки на анизотонические условия. Учитывая специфику функционирования бластомера мыши, например, низкий уровень активности Na+/K+АТФазы или отсутствие Na+-H+ обмена, не корректно знания, накопленные для клеточных культур, переносить на эмбриональную клетку. Поэтому представляет интерес изучение причин, лежащих в основе RVD ответа, который показан нами для двухклеточного эмбриона мыши (рис. 6).

Для соматической клетки в качестве регуляторов компенсаторной реакции в литературе рассматривают ряд причин (Sarkadi, Parker, 1991; Hoffmann, Dunham, 1995).

Основными адаптивными механизмами являются активный транспорт ионов посредством насосов и модификация функций ионных каналов, обусловленная, например, изменением рН среды или трансформацией цитоскелета. С учетом физических факторов, лежащих в основе этих механизмов, они классифицируются как электросмос (Praissman et al., 1973a) и аномальный осмос (Praissman et al., 1973b). В данном исследовании влияние указанных причин изучали в экспериментах с ингибированием Na+/K+-АТФазы, изменением рН среды инкубации, а также деполимеризацией актина под действием цитохалазина Б. Рисунок 11 суммирует экспериментальные результаты ингибиторного анализа.

Рисунок 11. Изменение объема бластомера двухклеточного эмбриона мыши в течение гипоосмотического стресса в растворе Дульбекко:

«контроль» -- в среде 70 мМ соли NaCl, «ЦХБ» - в среде содержится цитохалазин Б (5 мкг/мл), «рН 6.4» - калиевая блокада Na+/K+-АТФазы при рН 6.4. Кривая в растворе без ионов калия при рН 7.совпадает с контролем. Указаны средние значения и разброс (стандартная ошибка среднего), * -- P < 0.05 по сравнению с аналогичной точкой по времени на кривой «контроль» (критерий Стюдента, t-test).

Анализ осмотического ответа (рис. 11) показывает, что 15 минут прединкубации в изотоническом растворе Дульбекко не оказывает значимого влияния на кинетику ответа на последующий гипотонический шок (контроль). Схожая кривая регистрируется в похожих условиях, когда эмбрион подвергается стрессу сразу после выделения из яйцевода (рис. 6). Чтобы в компенсаторном ответе бластомера вычленить вклад электроосмоса, мы ингибировали Na+/K+-АТФазу, которая обеспечивает активный транспорт катионов К+ и Na+, поддерживая электрический потенциал на цитоплазматической мембране. Для этого эмбрион инкубировали в условиях калиевой блокады, когда в раствор Дульбекко вместо калиевых солей (4.2 мМ) эквимолярно добавляли NaCl.

Из сравнения кинетических кривых (рис. 11) видно, что калиевая блокада активного транспорта не отменяет компенсаторную реакцию эмбриона, т.е.

электрогенная составляющая не вносит заметный вклад в RVD ответ бластомера. Этот факт соответствует известным данным о физиологии клетки раннего эмбриона, для которой характерна низкая активность Na+/K+-АТФазы (Van Winkle, Campione, 1991;

Watson, Kidder, 1998), низкий уровень мембранного потенциала (Slack, Warner, 1973) и высокая цитоплазматическая концентрация натрия (Slack et al., 1973). В интактной среде предусмотрены дополнительные условия блокирования Na,K- насоса. Например, в просвете яйцевода обнаружена высокая концентрация аминокислоты таурина и ионов калия – факторов, ингибирующих Na+/K+-АТФазу. Отметим, что адаптивная реакция на осмотический шок, не зависящая от Na+/K+-АТФазы, показана и для дифференцированных клеток (Schmidt, McManus, 1977).

Изменение активности мембранных белков при кислых значениях рН блокирует аномальный осмотический ответ (Grim, Sollner, 1957). На рисунке 11 также приведены результаты эксперимента, в котором на фоне ингибирования Na+/K+-АТФазы понижается рН (рН 6.4) раствора Дульбекко. Наши данные свидетельствуют о том, что при этом начальная фаза гипоосмотического шока менее выражена, но последующая компенсаторная реакция сохраняется. Возможно, этот эффект, наблюдаемый при низких значениях рН, обусловлен модификацией транспорта воды (Cahalin, Hall, 1999;

Yasui et al., 1999b) или активизацией Na+/H+-обмена.

Изменение состояния цитоскелета, обусловленное изменением натяжения и радиуса кривизны мембраны (stretch фактор), является естественным сигнальным и регуляторным фактором при осмотическом шоке. Микрофиламенты могут напрямую участвовать в активации ионных механочувствительных каналов (Sachs, 1991) или опосредованно, осуществляя доставку специализированных белков из цитоплазмы к мембране (Foskett, Spring, 1985). Показано, что механическая деформация цитоскелета активирует каскады вторичных мессенжеров: протеинкиназу С (Rosales, Sumpio, 1992), аденилатциклазу (Watson, 1991), фосфолипазу А2 (Thoroed et al., 1994).

В связи с изложенным выше представляется важным исследовать вклад актин обусловленной регуляции в адаптацию эмбриона к гипотоническим условиям.

Результат этой части исследований иллюстрирует рисунок 11. Видно, что на фоне действия цитохалазина Б выраженной компенсаторной реакции не наблюдается.

Другими словами, у клетки раннего зародыша мыши определяющим условием для RVD ответа является актин обусловленная регуляция. Отметим, что такой тип осмотического поведения характерен для ряда дифференцированных клеток (Foskett, Spring, 1985; Hoffmann, Kolb, 1991; Cornet et al., 1993).

Плавное уменьшение объема бластомера при отмене цитохалазином Б компенсаторной реакции (рис. 11) можно объяснить пролонгированной диффузией осмотически активных аминокислот из клетки в гипотонических условиях (SanchezOlea et al., 1991). Например, для многих типов соматических клеток показан выход таурина в течение RVD (Garcia et al., 1991; Schousboe et al., 1991; Thoroed, Fugelli, 1994). В последней работе отмечают, что в цитоплазме указанная аминокислота содержится в концентрации до 75 мМ, достаточной для того, чтобы играть заметную роль в компенсаторной реакции на гипотонический шок (Solis et al., 1990).

Таким образом, для клетки раннего эмбриона мыши определяющим условием является актин обусловленная регуляция. Не следует исключать из рассмотрения механочувствительные каналы (Christensen, Hoffmann, 1992; Sackin, 1994). Возможно, механическая трансформация цитоскелета и деформация мембраны связаны в единый исполнительный механизм. Например, известно, что актин регулирует свойства ионных каналов (Cantiello et al., 1991; Kubalski et al., 1993). Завершая обсуждение результатов можно сделать следующие выводы.

Выводы 1. Разработан метод прямого измерения объема отдельного бластомера мыши, основанный на лазерной сканирующей микроскопии и последующей трехмерной реконструкции клетки.

2. Показано наличие у бластомеров механизма компенсации набухания клетки для гипотонических условий, моделируемых изменением в растворе Дульбекко концентрации соли NaCl в диапазоне от 60 мМ до 100 мМ.

3. Установлено, что компенсация набухания бластомера при гипотонии обусловлена цитоскелетом и снимается действием цитохалазина Б. Обнаружено, что Na+/K+-АТФаза и понижение рН среды не вносят заметный вклад в регуляцию аномального осмотического ответа эмбриональной клетки.

4. Показано, что обычная среда Дульбекко, содержашая 140 мМ соли NaCl, оказывает слабый гипертонический эффект.

5. Экспериментально получено значение проницаемости мембраны бластомера для воды, которое составляет 0,3 мкм/(мин*атм).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи:

1. Погорелова М.А., Яшин В.А., Погорелов А.Г., Голиченков В.А., 2008.

Количественная томография раннего эмбриона мыши. Доклады Академии Наук, 418(5): 712-714.

2. Погорелова М.А., Голиченков В.А., Яшин В.А., Погорелов А.Г., 2009.

Трехмерная реконструкция двухклеточного эмбриона мыши посредством лазерной сканирующей микроскопии. Вестник Московского университета (Биология), 3: 2327.

3. Погорелова М.А., Гольдштейн Д.В., Погорелов А.Г., Голиченков В.А., 2009.

Анализ изменения объема клетки раннего эмбриона мыши, подверженного осмотическому шоку. Клеточные технологии в биологии и медицине, 3: 169-172.

Материалы конференций:

1. Погорелов А.Г., Аксиров А.М., Голиченков В.А., Погорелова М.А., Яшин В.А.

Анализ изменения объема бластомера мыши в результате осмотического шока: 3-D реконструкция и лазерная сканирующая микроскопия. «II съезд Общества клеточной биологии» (С.-Петербург, 2007), Цитология, 49, 784.

2. Погорелова М.А., Голиченков В.А., Яшин В.А. Количественная томография 2-х клеточного эмбриона мыши: 3-D реконструкция и лазерная сканирующая микроскопия. В сб. «11-я Международная Пущинская Школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2007), 19-20.

3. Погорелова М.А., Голиченков В.А., Погорелова В.Н., Яшин В.А.

Количественная томография раннего эмбриона мыши после осмотического шока: 3-D реконструкция и лазерная сканирующая микроскопия. В сб. «Школа- конференция молодых ученых, аспирантов и студентов «Биомедицинская инженерия -2007» (Пущино, 2007), 27-30.

4. Погорелова М. А., Голиченков В.А., Погорелова В.Н. Количественная томография раннего эмбриона мыши в условиях осмотического шока: 3-D реконструкция и LSM. В сб. «Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008», секция «Биология» (Москва, 2008), 242.

5. Pogorelova M. A., Golichenkov V. A., Pogorelova V.N., Yashin V.A., Pogorelov A.G. LSM and 3-D reconstruction for volume quantitation of early mouse embryo. In: Int.

Symposium «Biological motility: achievements and perspectives» (Pushchino, 2008), 252254.

6. Pogorelova M.A, Golichenkov V. A., Pogorelova V.N. The effect of osmotic shock on the early mouse embryo volume. The Scandinavian Physiological Society’s Annual Meeting (Oulu, Finland, 2008), Acta Physiologica, 193(S.664), 106-107.

7. Pogorelova M. A., Golichenkov V. A., Pogorelova V.N. LSM tomography of 2-cell mouse embryo. In: the 14th European Microscopy Congress (Aachen, Germany, 2008), 1, 827-828.

8. Голиченков В.А., Погорелова М.А., Погорелов А.Г. Компенсаторное изменение клеточного объема раннего эмбриона мыши в гипотонических условиях. В сб. «ХV Школа «Актуальные проблемы биологии развития» (Звенигород, 2008), 14-15.

9. Pogorelova M. A., Golichenkov V. A., Pogorelova V.N. Microtomography of 2-cell mouse embryo with Laser Scanning Microscopy. The 9th Asia-Pacific Microscopy Conference (Jeju, Korea, 2008), Korean J. Microscopy, 38(No.4 S.), 1239-1240.

10. Погорелова М.А., Голиченков В.А., Погорелова В.Н. Изменение объема ооцита и раннего эмбриона мыши при гипотонии. В сб. «12-я Международная Пущинская Школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008), 184-185.

11. Погорелова М.А., Тарасов А.И., Панаит А.В., Корниенко Е.В. Актинобусловленный ответ эмбриональной клетки на осмотическое воздействие. В сб.

«Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов2009», секция «Биология» (Москва, 2009), 28.

12. Погорелова М.А., Тарасов А.В., Панаит А.И., Корниенко Е.В. Измерение объема клетки раннего эмбриона посредством лазерной сканирующей микроскопии. В сб. «XVI Российский симпозиум по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел» (Черноголовка, 2009), 242.

13. Погорелова М.А, Гольдштейн Д.В., Погорелов А.Г., Голиченков В.А.

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»