WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

К тому же традиционные подходы подготовки образцов для микроскопии содержат принципиальные ограничения. Первый этап химической фиксации и последующая дегидратация в спиртах приводят к необратимой инактивации мембранных белков, в том числе, ответственных за транспорт воды (аквапорины) и ионов (ионные каналы и насосы). Таким образом, уже на начальной стадии подготовки препарата полностью ингибируется комплекс механизмов, ответственных за осмотический ответ клетки и, как следствие, наблюдается неконтролируемое изменение клеточного объема. Чтобы получить препарат, в котором сохранены прижизненные объемные характеристики зародыша, мы применили сверхбыстрое замораживание раннего эмбриона мыши (Echlin, 1992).

Необходимость быстрой фиксации эмбриона в заданный момент эксперимента обусловлена также высокой скорость осмотического ответа, когда процесс развивается в течение нескольких минут. В нашем эксперименте время фиксации в переохлажденном (-188°С) жидком пропане сокращено до интервала ~ 0.01 секунды.

Однако пока нет подходов, которые обеспечивают более быструю фиксацию физических параметров клетки, чем сверхбыстрая заморозка.

Последовательность подготовки препарата двухклеточного эмбриона мыши для количественной микротомографии совпадает с методом freeze-drying, который был предложен для электронно-зондового микроанализа цитоплазматической концентрации элементов (Ingram et al., 1972). После низкотемпературной дегидратации в вакууме образцы заключали в заливочную среду, подготовленную на основе эпоксидной смолы Epon 812, которая широко применяется в электронной микроскопии для получения ультратонких срезов. Достоинство используемой смолы заключается в том, что она не деформирует структуру клетки в процессе подготовки объекта.

Препарат исследовали в лазерном сканирующем микроскопе, используя «красный» HeNe лазер. Излучаемый свет длиной волны 633 нм не поглощается в заливочной среде Epon 812, которая обладает оранжевым цветом. Важным параметром режима наблюдения в проходящем свете является глубина, на которой расположен объект относительно поверхности. Поэтому толщина слоя заливочной среды не должна превышать 270 мкм. На рисунке 2 показана микрофотография эмбриона в плоскости оптического среза, прошедшего вблизи диаметрального сечения.

Рисунок 2. Характерное изображение двухклеточного эмбриона мыши в плоскости оптического среза, полученной посредством лазерной сканирующей микроскопии.

(А) микрофотография препарата неокрашенного зародыша и (Б) тоже изображение после обработки графическим редактором, Бл – бластомер, Я - ядро, Пп – перивителлиновое пространство, Зп – zona pellucida.

Видно (рис. 2А), что для оптического среза характерен низкий контраст и это обусловлено отсутствием красителей, зондов или других контрастирующих веществ в разработанной нами методике. Морфологические особенности эмбриона (рис. 2Б) выделены в результате автоматизированной обработки цифрового изображения посредством стандартных средств графического редактора Adobe Photoshop 6.0.

Другими словами, в результате математического контрастирования получен четкий контур бластомера в плоскости среза, что необходимо для трехмерной реконструкции клетки.

Предложенный нами алгоритм компьютерного контрастирования (псевдо DIC) аналогичен режиму дифференциально-интерференционного контраста в его варианте применительно к микронному срезу (тонкий объект постоянной линейной толщины).

Разница состоит в том, что в нашем случае сравнивали не расщепленные изображения одного объекта, а два последовательных оптических среза. При этом относительный сдвиг изображений в плоскости «XY» обусловлен изменением геометрии сечения бластомера в вертикальном направлении.

Пространственное разрешение метода лазерной микротомографии по «Z» оси составляет приблизительно 320 нм (Штейн, 2009). Наши наблюдения показали, что после графической обработки контраст изображения можно получить при расстоянии 0,5 микрона между оптическими срезами. Однако оптимальным является шаг в микрон, что обеспечивает удовлетворительное качество конечного изображения, уменьшает требуемый ресурс компьютерной памяти и значительно ускоряет процедуру трехмерной реконструкции эмбриона. Оконтуривание бластомера, последующее за графическим контрастированием изображения, и трехмерная реконструкция клетки проводятся стандартными средствами редактора 3ds max 5.

Рисунок 3 иллюстрирует по этапам результаты цикла обработки цифрового изображения серии оптических срезов на компьютере.

Рисунок 3. Результаты компьютерной обработки цифрового изображения серии оптических срезов по этапам. (А) - получение цифрового изображения оптического среза в лазерном сканирующем микроскопе, (Б) - контрастирование изображения в редакторе Adobe Photoshop 6.0, (В-Е) - манипуляции в среде 3ds max 5: обрисовка контура бластомера, разнесение по оси «Z» контуров бластомеров, нанесение базисной сетки на поверхность компьютерной модели бластомера и визуализация компьютерной модели бластомера, соответственно.

Отработанные методические приемы и программные подходы также могут быть использованы для обычного наблюдения морфологии эмбриона в режиме световой микроскопии на полутонких срезах. При этом получаем галерею последовательных изображений сечения зародыша на разных его уровнях по глубине (рис. 4). Таким образом, разработанная технология микротомографии двухклеточного эмбриона мыши может быть применена без разрушения препарата в разных направлениях морфологического контроля: визуализация объекта в пространстве, количественное определение его объемных параметров, изучение строения зародыша с высоким пространственным разрешением.

В процессе лазерной микротомографии образец не разрушают, как при микротомии, поэтому, в последующем, препарат может быть использован для других методов исследования. Следовательно, появляется возможность комбинированного анализа одной клетки разными подходами. Привлечение электронно-зондового микроанализа (Warley, 1997) позволит определить цитоплазматическую концентрацию ряда биогенных элементов в течение осмотического шока. Например, внутриклеточное содержание основных осмотически активных неорганических ионов (K+, Na+, Cl-) или фосфора и серы, которые опосредованно характеризуют выход из клетки свободных серосодержащих аминокислот или легкодиффундирующих органических фосфатов.

Рисунок 4. Изображения неокрашенного двухклеточного эмбриона мыши в плоскости сечения, прошедшего на разной глубине, с разницей в 14 микрометров. Бл – бластомер, Я - ядро, Зп – zona pellucida, Пт – полярное тельце, С – остаток сухих солей, входящих в раствор Дульбекко, которые выпали в течение низкотемпературной дегидратации.

Наш опыт показал, что разработанные подходы количественной лазерной микротомографии могут быть применимы и на более поздних стадиях раннего эмбриогенеза (рис. 5).

Рисунок 5. Изображение раннего эмбриона мыши на стадии трех (верхний рисунок) и четырех бластомеров.

(А) -- объемное изображение, полученное в результате трехмерной реконструкции, (Б) -- микрофотография того же эмбриона в плоскости сечения одного из оптических срезов. Бл – бластомер, Я - ядро, Пт- полярное тельце, Зп – zona pellucida, V – объем бластомера.

Количественное сравнение показывает, что уже после второго деления регистрируется значительное уменьшение объема эмбриона. По завершении первого клеточного цикла суммарный клеточный объем (~118*103 мкм3) почти в 1,5 раза больше объема (~76*103 мкм3) всех бластомеров, который наблюдается на стадии четырех клеток. Учитывая унификацию экспериментальных подходов и компьютерных программ, используемых нами при изучении двухклеточного эмбриона мыши, нет принципиальных ограничений применению количественной микротомографии для анализа препаратов раннего зародыша других видов млекопитающих. Однако высокие требования к стабильности положения объекта в пространстве не позволяют проводить наблюдения интактного эмбриона в режиме on line. Кроме того, время накопления данных (Z-stack) соизмеримо с развитием осмотического ответа клетки, что потребовало фиксации эмбриона во времени посредством сверхбыстрой низкотемпературной заморозки.

Осмотическая реакция эмбриона на гипотонические условия Разработанная нами технология количественной микротомографии раннего эмбриона мыши была применена для изучения кинетики осмотического ответа бластомера в анизотонических условиях. Рисунок 6 иллюстрирует характерное осмотическое поведение бластомера двухклеточного эмбриона мыши в ответ на гипотонический стресс.

Рисунок 6. Характерная кривая изменения объема бластомера двухклеточного эмбриона мыши в гипоосмотических условиях, моделируемых уменьшением в растворе Дульбекко концентрации (80 мМ) соли NaCl. За начальную точку (контроль) принят объем клетки сразу после выделения эмбриона из яйцевода.

Указаны средние значения и разброс (стандартная ошибка среднего), * -- P < 0.05 по сравнению с контролем (критерий Стюдента, t-test) В кинетике ответа эмбриона на гипотонический шок (рис. 6) выделяется две фазы. В начале воздействия, в соответствии с законом Вант-Гоффа, наблюдается быстрое набухание бластомера. Затем эмбриональная клетка медленно восстанавливает объем до исходного уровня.

Начальная фаза набухания эмбриона Эмбрион, подверженный гипотоническому стрессу, принимает максимальный размер в области 10 минут после начала действия анизотонических условий (рисунок 6). В этот период он ведет себя, как обычный осмометр, так как увеличение объема линейно зависит от изменения осмотичности среды (рис. 7).

Рисунок 7. Приращение на минуте гипотонического стресса объема (V) бластомера двухклеточного эмбриона мыши относительно начального размера клетки в зависимости от уменьшения концентрации (С) соли NaCl в растворе Дульбекко.

Указаны средние значения и разброс (стандартная ошибка среднего), пунктиром показана экстраполяция линии до точки пересечения с осью абсцисс.

Из экстраполяции линейной зависимости (рис. 7) до пересечения с осью концентраций можно предположить, что набухание клетки будет отсутствовать в растворе Дульбекко, содержащем около 120 мМ соли NaCl. Среды с более высокой концентрацией натриевой соли будут вызывать гиперосмотичную реакцию, т.е. сжатие клетки. Другими словами, уменьшение объема прогнозируется и для обычного раствора Дульбекко, который содержит 140 мМ NaCl. Полученные данные позволяют оценить проницаемость мембраны раннего эмбриона мыши для воды, используя известное выражение (1):

Lp = (Vt/P)/(S t) (1), где Lp – проницаемость для воды, V – приращение объемами клетки на начальном интервале (t) гипоосмотического воздействия, P -разница между осмотическим давлением в изотонической и гипотонической среде, S – площадь поверхности бластомера.

На промежутке 5 минут гипотонического стресса отношения V/P, рассчитанное из наклона линии (рис. 7), составляет ~0,6*103 мкм3/мМ (0,3*мкм3/мОсм). Площадь поверхности (~8*103 мкм2) бластомера двухклеточного эмбриона мыши определяли посредством лазерной микротомографии. В соответствие с выражением (1) проницаемость для воды равна ~0,01 мкм/(мин*мОсм) или 0,мкм/(мин*атм) при 28°C. Данная величина близка по значению к той, что определена на стадии MII зрелого ооцита мыши (Gao et al., 1994, 1996; Agca et al., 1998). Таким образом, для раннего эмбриона мыши нами получен один из основных интегральных показателей, характеризующих функциональное состояние изолированной клетки.

Фаза аномального осмотического ответа За начальной фазой набухания эмбриона следует фаза восстановления его объема (рис. 6). Такой вид реакции, не согласующийся с предсказанием закона ВантГоффа, называют аномальным осмосом и описывают термином «regulatory volume decrease». Ответ, характерный для RVD, показан для ряда культур клеток и форменных элементов крови (Buckhold Shank et al., 1973). В цитируемой литературе используется простое эмпирическое выражение для представления кинетики осмотических изменений объема клетки. Применительно к бластомеру двухклеточного эмбриона мыши это выражение для фазы RVD принимает следующий вид:

V(t) = Vfin + (Vmax -Vfin)exp(-t) (2), где V(t) – объем эмбриональной клетки в момент времени t, Vmax - максимальный объем бластомера при набухании в гипотонической среде, Vfin – конечное значение клеточного объема после установления равновесного состояния, - коэффициент пропорциональности.

Началом (t=0) RVD фазы рассматривают момент максимального набухания клетки. Равновесное состояние (Vfin) устанавливается на отдаленных интервалах, когда объем клетки возвращается к исходному значению. Для удобства расчета берется значение временного промежутка t. В результате адаптивной реакции в гипотонических условиях клетка со временем восстанавливает свой размер до исходного значения. Кинетика компенсаторного ответа характеризуется коэффициентом «», средняя величина которого определена нами числом 0,07±0,мин-1.

Осмотическая реакция эмбриона в условиях, приближенных к физиологическим Рисунок 8 демонстрирует сравнительные данные изменения объема бластомера со временем в гипотоническом и обычном растворе Дульбекко, содержащем 100 мМ и 140 мМ соли NaCl, соответственно. Инкубация в указанных условиях вызывает схожий по величине, но обратный по направленности, осмотический ответ.

Рисунок 8. Изменение со временем объема бластомера двухклеточного эмбриона мыши в среде Дульбекко, содержащей 100 мМ и 140 мМ соли NaCl. За начальную точку (контроль) принят объем клетки сразу после выделения эмбриона из яйцевода.

Указаны средние значения и разброс (стандартная ошибка среднего), * -- P < 0.05 по сравнению с контролем (критерий Стюдента, t-test).

Рассмотрение кинетических кривых (рис. 8) свидетельствует о том, что в среде Дульбекко изоосмотические условия для изолированного двухклеточного эмбриона мыши возможны в интервале концентраций 100 мМ 140 мМ соли NaCl. Это заключение согласуется с нашим прогнозом, следующим из анализа реакции бластомера на гипотонический стресс (рис. 7). В растворе Дульбекко, как и в гипотонических условиях, в течение эксперимента наблюдается восстановление объема бластомера до начального значения. Этот факт свидетельствует о наличии механизмов, направленных на компенсацию действия гиперосмотического шока, индуцируемого обычной средой Дульбекко. В этом случае на начальном этапе наблюдается не только сжатие (~16%) эмбриона, но и характерное изменение формы клетки (рис. 9).

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»