WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 ||

3.7. После образования АФК в клетках происходила деполяризация и фрагментация митохондрий. Добавление антиоксидантов (N-ацетилцистеина) предотвращало образование АФК и фрагментацию митохондрий (Рис. 9). На основание этого мы заключили, что фрагментация митохондрий индуцируется АФК. Заметим, что фрагментация митохондрий происходит и в некоторых вариантах апоптоза животных клеток (Skulachev et al. 2004).

Рисунок 9. Фрагментация митохондрий в родительской линии клеток W3031B (а-с) и в мутанте ysp1 (d). Объемная реконструкция серии снимков с меняющимся фокусом клеток, окрашенных митотрекером оранжевым.

Контрольные клетки (а), клетки, обработанные амиодароном (b,d), клетки, обработанные амиодароном и 30 мМ N-ацетилцистеином (c).

3.8. Мы решили исследовать, на каком этапе каскада действует идентифицированный нами белок Ysp1p. Анализ аминокислотной последовательности этого белка выявил, что он содержит один трансмембранный домен и PH (plextrin homology)-домен, который, повидимому, выполняет регуляторную функцию. Анализ информации, имеющейся в общедоступных базах данных (SGD) указывал на то, что этот белок локализован в митохондриях, хотя и не содержит в себе митохондриальной адресной последовательности. Эти данные подтверждались тем, что в наших условиях Ysp1p, соединенный с GFP (зеленым флуоресцентным белком), колокализовался с митотрекером оранжевым в клетках. Мы показали, что мутанты, лишенный гена YSP1, более устойчивы к феромону и амиодарону (Рис 4, 6), однако гиперполяризация митохондрий и образование АФК, вызываемые этими веществами, оказались такой же интенсивности, как и у клеток дикого штамма. Единственное отличие заключалось в том, что на поздней стадии процесса не происходило деполяризации и фрагментации митохондрий (Рис 9).

Рисунок 10. Предполагаемая схема каскада программируемой гибели Saccharomyces cerevisiae, вызванной феромоном или амиодароном.

4. Заключение На основании полученных данных нами была предложена следующая схема событий, вызываемых добавлением высокой концентрации феромона к клеткам противоположного типа спаривания (Рис. 10). Феромон в высокой концентрации активирует каскад МАР-киназ, что приводит к экспрессии некоторых генов (Рис. 10, 1-4). Активность продуктов этих генов вызывает увеличение концентрации цитоплазматического кальция, что, в свою очередь, непосредственно или при помощи определенных белков вызывает сокращение утечки протонов сквозь внутреннюю мембрану митохондрий и активации NADH дегидрогеназ (Рис. 10, 5-6). Это, в свою очередь приводит к увеличению трансмембранного потенциала на внутренней мембране митохондрий, что служит причиной увеличения скорости образования АФК комплексом III дыхательной цепи. АФК вызывают деполяризацию и фрагментацию (или набухание) митохондрий, выход цитохрома с из межмембранного пространства митохондрий (Рис. 10, 7-10). Инактивация гена YSP1 подавляет фрагментацию митохондрий и снижает процент гибели клеток.

5. Основные выводы 1. Предложена схема событий, происходящих в клетках дрожжей S.

cerevisiae при клеточной смерти, вызванной феромоном. При повышении концентрации цитоплазматического кальция амиодароном или Aнаблюдается гиперполяризация митохондрий и образование активных форм кислорода. Показано, что повышение митохондрий является причиной образования АФК.

2. Показано, что добавление антиоксидантов предотвращает фрагментацию митохондрий и гибель клеток, вызванные амиодароном.

3. АФК являются не эпифеноменом клеточной смерти, вызванной феромоном или амиодароном, а необходимым компонентом каскада самоубийства.

4. Идентифицированы гены, предположительно участвующие в реализации или регуляции программируемой клеточной смерти у дрожжей.

Показано, что функция гена YSP1 необходима для протекания программы самоубийства клеток, вызванной амиодароном или избытком феромона.

5. Идентифицирована функция гена YSP1, который оказался необходим для фрагментации митохондрий, вызываемой АФК при программируемой гибели клеток. Показана митохондриальная локализация продукта этого гена.

6. Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Knorre, D.A., Dedukhova, V.I., Vyssokikh, M.Yu., and Mokhova, E.N. (2003) Cyclosporin A-sensitive cytochrome c release and activation of external pathway of NADH oxidation in liver mitochondria due to pore opening by acidification of phosphate-containing incubation medium. Bioscience Reports 23 (2-3): 67-75.

2. Кнорре Д.А., Смирнова Е.А. и Северин Ф.Ф. (2005) Естественные условия для запрограммированной гибели дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Биохимия 70 (2): 323-326.

3. Pozniakovsky, A.I., Knorre, D.A, Markova, O.V., Hyman, A.A., Skulachev, V.P. and Severin, F. F. (2005) Role of mitochondria in the pheromone- and amiodarone-induced programmed death of yeast. J. Cell. Biol. 168 (2): 257-269.

4. Кнорре, Д.А., Дедухова, В.И., Мохова, Е.Н (2002) Уменьшение рН среды инкубации вызывает активацию внешнего пути окисления экзогенного NADH, открытие Са2+-зависимой циклоспорин А чувствительной поры и выход цитохрома С из митохондрий печени крысы. III съезд биохимического общества (2002), Санкт-Петербург, Россия, с. 248-249.

5. Knorre, D.A., Pozniakowski, A., Hyman, A.A., Severin, F.F. (2003); Genetic screen for activators of pheromone induced apoptosis-like death in yeast Europ. J.

Biochem., Supplement 1, P4.8-31.

6. Кнорре, Д.А., Смирнова, Е.А., Северин, Ф.Ф. (2004) Роль митохондрий в запрограммированной гибели Saccharomyces cerevisiae, вызванной половым феромоном. Ломоносовские чтения, с. 7. Knorre, D.A., Markova, E.A., Smirnova, E.A., Rikhvanov, E.G., Severin, F. F.

(2005) Fate of mitochondria in yeast programmed death. Международная конференция «Российская биоэнергетика: от молекул к клетке», Москва, МГУ, с. 28.

Pages:     | 1 | 2 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»