WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Для того чтобы исключить пункт 2, мы проверяли способность выживших клеток спариваться с клетками противоположного типа спаривания и в дальнейшем рассматривали только эти мутанты. Для исключения пункта 3 мы проверяли способность клеток расти на несбраживаемом субстрате (глицерине) и в дальнейшем использовали только эти мутанты. Полученный набор мутантов мы проверяли еще два раза на устойчивость к феромону и, если они проявляли стабильную устойчивость, определяли какого участка геномной ДНК они лишены (схема генетического скрининга представлена на рисунке 3).

В полученных мутантных линиях клеток определяли расположение вставки транспозона. Для этого из дрожжей выделяли геномную ДНК и расщепляли рестриктазой Hind III. В кассете генов, содержащейся в транспозоне, содержался единственный сайт для рестриктазы Hind III, поэтому в результате рестрикции мы получали смесь фрагментов геномной ДНК и фрагмент ДНК, содержащей наряду с геномной ДНК участок транспозона до сайта рестрикции Hind III. Полученную смесь фрагментов лигировали с плазмидой pBC KS+, обработанной рестриктазой Hind III и ДНК фосфатазой. Далее смесь плазмид трансформировали методом электропарации в бактерии E. coli линии ХL-1 Blue. Трансформированные бактерии выращивали на твердой среде с добавленными хлорамфениколом и ампициллином. В этих условиях вырастали только те бактерии, в которые была трансформирована плазмида, содержащая фрагмент транспозона и, следовательно геномной ДНК дрожжей. Из полученных штаммов бактерий выделяли плазмидную ДНК и секвенировали ее. Полученные последовательности сравнивали с помощью программы для выравнивания последовательностей BLAST с геномной ДНК дрожжей и идентифицировали ген (или гены), нарушенные в результате встраивания транспозона. В результате, были идентифицировано 28 генов, которые представленны в таблице 1.

Обсуждение роли каждого конкретного гена, обнаруженного в результате скрининга, выходит за рамки работы. Все обнаруженные гены могут быть разделены на несколько групп.

Таблица 1. Гены, предположительно участвующие в регуляции или реализации каскада клеточного самоубийства дрожжей, вызванного высокой концентрацией полового феромона.

N ORF Названия гена 1 YCR105W ADH2 YHR155W YSP1* 3 YFR044C YFR044c 4 YLR044C PDC5, YPL064C CWC6 CWC7 YLR371W ROM8 YOR121C YOR121C 9 -10 YDR335W MSN11 YDR102C и YDR103W YDR102C и STE12 YLL021W SPA2/FUS6/PEA13 YDL005C MED14 YDR181C SAS15 YOR213C SAS16 YNL257C SIP17 YNL236W SIN4/BEL2/GAL22/MED18 YDL135C и PPH21 RDI1 и PPH19 RDN58-1, RDN18-1/ RDN58-2, RDN58-1, RDN18-1/ RDN58-2, RDN18-2 RDN18-20-21 YLR163C MAS1/MIF22-23 YLR119W SRN2/SRN10/VPS24 YDR336W YDR336W 25 YPR148С YPR148С 26 YMR114С и/или YMR115w YMR114С и/или FMP27 YLR162W YLR162W 28 YBR108W YBR108W Одни из них (MSN5, STE5 и SPA2) участвуют в регуляции полового каскада и, следовательно будут оказывать влияние и на апоптотический каскад, вызванный феромоном. Однако в настоящей работе нас в большей степени интересовали белки, участвующие на поздних этапах каскада самоубийства. Второй группой генов оказались транскрипционные факторы и глобальные регуляторы транскрипции (MED2, SAS4, SAS5, SIP3);

нарушение их функции влияет на уровень экспрессии очень большого числа генов, поэтому мы также не стали получать клеточные линии, лишенные этих генов. Также, в рамках работы, нас не интересовали гены рибосомальной РНК, гены, инактивация которых летальна (MAS1) или приводит к значительному замедлению роста на несбраживаемых субстратах (YDR336W). Из оставшихся генов для дальнейшего изучения были выбраны генов: ADH1, YHR155W, PDC1, YLR044C, CWC27 и YOR121C. Мы полагали, что интерес представляют гены с неизвестными функциями, а также ген CWC27, который оказался гомологом генов, кодирующих циклофилины, которые входят в состав Са2+-зависимой, CsA-чувствительной поры митохондрий многоклеточных животных. Поэтому дальнейшая наша задача заключалась в том, чтобы определить, будет ли направленная инактивация обнаруженных нами генов понижать восприимчивость клеток к половому феромону. Для этого методом ПЦР мы сконструировали фрагмент ДНК, состоящий из гена HIS1, фланкированного участками геномной ДНК дрожжей, соответствующих участкам ДНК, фланкирующим гены, которые необходимо было инактивировать. Этими фрагментами ДНК мы трансформировали штамм W303-1B cmd1-6. Таким образом, было получено мутантов: yfr044c, cwc27, pdc1, yhr155w, ycr105w, rom2,, yor121.

Однако 4 из 7 полученных мутантов (cwc27, pdc1, yor121 и rom2) оказались неустойчивыми к половому феромону, что указывало на то, что эффективность нашего скрининга составляет приблизительно 40%. В оставшихся мутантных клетках мы определили скорость роста в среде, содержащей глицерин в качестве источника углеродов и отбросили мутант yfr044с, у которого скорость удвоения в этих условиях оказалась в 1,7 раза меньше, чем у остальных мутантов и родительской линии.

На основании полученных данных для дальнейшего изучения был выбран белок, кодируемый геном YHR155W. Он был инактивирован у клеток штамма W303-1B с помощью той же конструкции, что была использована на клетках W303-1B cmd1-6. Инактивация гена приводила к резкому снижению процента гибели клеток в ответ на высокие (100 мкг/мл) концентрации фактора (Рис. 4). При этом клетки, лишенные гена YSP1, были даже несколько более чувствительны к низкой концентрации полового феромона.

30 % 25 % 20 % 15 % 10 % 5 % 0 % Рисунок 4. Снижение процента гибели клеток в штамме c инактивированным геном YSP1 или в присутствии антиоксидантов: 20 мкМ -токоферола или 30 мМ N-ацетилцистеина. ПКС дрожжевых клеток индуцировали -фактором (100 мкг/мл) и оценивали по окраске метиленовым синим через 4 часа после добавления индуктора.

Известно, что добавление даже низких концентраций полового феромона вызывает накопление ионов Сa2+ клетками дрожжей (Iida et al.

1990). Мы предположили, что повышение концентрации Сa2+ в цитоплазме Гибель клеток, % yspКонтроль токоферол Nацетилцистеин (как и в случае некоторых вариантов апоптоза многоклеточных) может являться сигналом в каскаде самоубийства клеток, вызванного высокой концентрацией полового феромона. Поэтому мы сравнили действие феромона с действием веществ, искусственно повышающих концентрацию внутриклеточного Сa2+: Сa2+-переносчика A23187 и неспецифического активатора Сa2+-каналов амиодарона. Оказалось, что все эти вещества приводят к (1) повышению мембранного потенциала митохондрий, (2) образованию АФК и (3) гибели клеток (Рис.5). Однако в случае А23187 все эти внутриклеточные события наблюдались только в 10% клеток, тогда как амиодарон вызывал быстрый ответ практически во всех клетках. Более того, гиперполяризация митохондрий, образование АФК и гибель клеток в ответ на амиодорон происходили в той же последовательности, что и при обработке клеток высокой концентрацией феромона, однако в случае амиодарона отсутствовал полуторачасовой лаг-период. На основание этих наблюдений мы предположили, что амиодарон вызывает ту же цепь событий внутри клетки, что и феромон, но на более поздней стадии – повышении концентрации внутриклеточного кальция. Поэтому для проведения ингибиторного анализа и дальнейшего изучения последовательности молекулярных событий программируемой клеточной смерти мы использовали амиодарон. Гибель клеток, вызванная амиодароном, происходила независимо от синтеза белка. Добавление 15 мкг/мл циклогексимида не приводило к увеличению процента выживших клеток, обработанных 80 мкМ амиодароном. Мутации, делающие клетки дрожжей стерильными (неспособными к половому размножению), также не влияли на их восприимчивость к амиодарону. В нашей лаборатории А. Позняковским и Ф. Севериным было показано, что в клетках, обработанных амиодароном наблюдалась фрагментация ядерной ДНК и выход цитохрома с в цитоплазму (Pozniakovsky et al., 2005). Для количественной оценки выхода цитохрома с был использован метод, описанный нами ранее (Knorre et al., 2002). Однако оказалось, что обработка клеток амиодароном сильнейшим образом влияла на метод выделения митохондрий на этапе получения протопластов, поэтому от использования этого метода в системе с амиодароном пришлось отказаться.

Рисунок 5. Повышение мембранного потенциала митохондрий и образование АФК клетками дрожжей в ответ на повышение концентрации внутриклеточного кальция. Флуоресценция митотрекера оранжевого (a-d), ДХФ-ДА (e-g) и дифференционно-интерференционный контраст (h). Контрольные клетки (а,е,h);

А23187, 50 мкМ (b,f); амиодарон, 80 мкМ, (с,g); феромон, 100 мкг/мл (d).

Фотография (h) показывает то же поле зрения, что и (е), но в проходящем свете.

3.5. Мы исследовали на восприимчивость к амиодарону различные мутантные линии S. cerevisiae: штамм W303-1B cyc3, лишенный цитохром c-гем лиазы, ответственной за образование обоих изоформ цитохрома с из апоцитохромов; - клетки, лишенные митохондриальной ДНК; штамм Wysp1; а также клетки, обработанные различными ингибиторами дыхательной цепи, разобщителями и антиоксидантами (Рис.6).

Рисунок 6. Действие различных ингибиторов и мутаций на восприимчивость клеток дрожжей к 80 мкМ амиодарону. Миксотиазол добавляли до конечной концентрации 7 мкМ; N-ацетилцистеин - 30 мМ; -токоферол - 20 мкМ. FCCP – трифлуорометоксикарбонилцианид фенилгидразон Оказалось, что клетки, обработанные миксотиазолом, ингибитором дыхательной цепи, а также мутанты, лишенные активной дыхательной цепи (cyc3 и -), были в значительно меньшей степени восприимчивы к амиодарону. Антиоксиданты (жирорастворимый витамин Е и водорастворимый N-ацетилцистеин) также предотвращали гибель, вызванную амиодароном. Из этого мы сделали вывод, что образование АФК и функционирующая дыхательная цепь митохондрий необходимы для реализации каскада событий, вызванного добавлением амиодарона.

3.6. Исследования методами флуоресцентной микроскопии показали, что образование АФК (по флуоресценции ДХФ-ДА, предварительно загруженного в клетки) происходило через 10-15 минут после добавления Число колоний, % yspcycКонтроль токоферол Миксотиазол FCCP, мкМ FCCP, 0,мкМ Nацетилцистеин амиодарона, в то время как потенциалзависимые митотрекер и тетраметилродамин (зонды на потенциал на митохондриальных мембранах) увеличивали интенсивность флуоресценции практически сразу же после добавления амиодарона. Интересно, что гиперполяризация наблюдалась как в клетках, выращенных на галактозе с раффинозой (то есть с нормально функционирующими митохондриями), так и в экспоненциально растущих на глюкозе клетках, то есть в условиях глюкозной репрессии.

В опытах по измерению дыхания целых клеток амиодарон вызывал резкое увеличение отношения скорости дыхания в присутствии FCCP к скорости дыхания в присутствии олигомицина, что хорошо коррелирует с данными флуоресцентной микроскопии и указывает на то, что амиодарон вызывает повышение трансмембранного потенциала (Рис.7). При этом важно отметить, что амиодарон не оказывал описанного выше эффекта на выделенные митохондрии, а в высоких концентрациях даже ингибировал дыхание. Это указывало на то, что на целых клетках гиперполяризацию митохондрий вызывает некий промежуточный фактор. Возможно, что таким фактором являются ионы кальция. Perez-Vazquez и соавторы (2003), показали увеличение дыхательного контроля митохондрий дрожжей S. cerevisiae за счет закрытия ионами кальция неспецифического митохондриального канала.

Из рисунка 7 видно, что амиодарон в концентрации 5 мкМ не вызывал изменения скорости дыхания. Олигомицин в концентрации от 10 мкг/мл до 100 мкг/мл также не влиял на скорость дыхания целых клеток S. cerevisiae, однако при одновременном добавление амиодарона (5 мкМ) и олгиомицина (10 мкг/мл) наблюдалось уменьшение скорости дыхания клеток (Рис.2).

Аналогичный эффект наблюдался в случае FCCP. Добавление 1 мкМ FCCP приводило к стимуляции дыхания дрожжевых клеток всего в 1,4 раза, тогда как в присутствии амиодарона FCCP стимулировал дыхание более чем в 2,раза.

Рисунок 7. Действие амиодарона на дыхание целых клеток. Скорость дыхания клеток (6*106 клеток/мл) измеряли полярографическим методом. Числа у кривых соответствуют скорости дыхания, нмоль O2/минуту на 107 клеток). Концентрация миксотиазола составляла 3,5 мкг/мл.

Этим эффектам, на наш взгляд, возможно два объяснения. Возможно, что амиодарон каким-то образом влиял на проницаемость цитоплазматической мембраны для этих веществ, или, действительно, происходила гиперполяризация митохондрий за счет (1) сокращения утечки протонов через внутреннюю мембрану и (2) активации NADH дегидрогеназ.

В пользу второго варианта свидетельствуют данные флуоресцентной микроскопии (в первые минуты после добавления амиодарона наблюдалось увеличение флуоресценции только потенциалзависимого митотрекера, но не других флуоресцентных зондов).

Было показано, что низкие концентрации FCCP (0,4 мкМ) вызывали увеличение выживаемости клеток, обработанных амиодароном, тогда как дальнейшее увеличение концентрации уменьшало этот эффект, а высокие концентрации (6 мкМ) даже немного увеличивали восприимчивость клеток к амиодарону. Аналогичный эффект наблюдали с другими разобщителями.

Кроме того, низкие концентрации FCCP предотвращали образование АФК, тогда как высокие – нет (Рис. 8). Полученные данные были подтверждены в нашей лаборатории Ф.Ф. Севериным флуоцитометрическими методами (Pozniakovski et al., 2005).

Рисунок 8. Образование АФК в ответ на добавление амиодарона в присутствии различных ингибиторов. Контроль, без амиодарона (а); амиодарон, мкМ (b-g): FCCP, 0,4 мкМ (b); FCCP, 6 мкМ (c); миксотиазол 2 мкМ (f); антимицин 10 мкМ (g).

Таким образом мы показали, что предотвращение гиперполяризации митохондрий предотвращает и образование АФК. Однако полная деполяризация митохондрий, происходившая в ответ на добавление 6 мкМ FCCP, не предотвращала образования АФК. Мы полагаем, что это связано с тем, что митохондрии, являясь основным источником АФК, одновременно являются и важным фактором, поддерживающим уровень антиоксидантов в клетке. Это согласуется с данными Grant и др. (1997), показавшими, что клетки дрожжей более восприимчивы к окислительному стрессу. Мы предположили, что местом образования АФК в дыхательной цепи митохондрий дрожжей является Q-цикл III дыхательного комплекса.

Действительно, добавление миксотиазола подавляло образование АФК в ответ на добавление амиодарона, а антимицин А, предотвращающий перенос электронов между цитохромами b и, таким образом, стабилизирующий убихинон в форме Q-., усиливал образование АФК (Рис.7).

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»