WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

КНОРРЕ Дмитрий Алексеевич Программируемая клеточная смерть Saccharomyces cerevisiae, вызванная феромоном 03.00.04 – биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена в отделе Биоэнергетики Научно Исследовательского Института Физико-Химической Биологии им А.Н.Белозерского при МГУ им.

М.В.Ломоносова

Научный консультант: академик РАН В.П.Скулачев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Звягильская Р.А.

доктор биологических наук, профессор Самуилов В.Д.

Ведущая организация: ГУ Российский Онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН

Защита состоится « 14 » июня 2005 года в 14 часов на заседании диссертационного совета К 002.247.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук в Институте биохимии имени А.Н. Баха РАН по адресу: 119071 Москва, Ленинский пр-т. 33, корп. 2

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы по адресу: 119071 Москва, Ленинский пр-т. 33, корп. 2 Автореферат разослан « 13 » мая 2005 года

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Орловский А.Ф.

2

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1. Актуальность темы Контролируемая элиминация клеток играет важную роль в онтогенезе, функционировании иммунитета и поддержании тканевого гомеостаза. До недавних пор считалось, что программируемая клеточная смерть (апоптоз) свойственна только многоклеточным животным или растениям (Vaux et al., 1996). Однако увеличение количества полностью отсеквенированных геномов позволило обнаружить гомологи апоптотических белков в одноклеточных эукариотах и даже в бактериях (Koonin & Aravind, 2002).

Одновременно было найдено, что программируемую клеточную смерть, сходную по цитологическим признакам с апоптозом высших эукариот, можно вызвать различными искусственными и природными индукторами у целого ряда одноклеточных организмов: дрожжей, кинетопластид, инфузорий, одноклеточных водорослей (см. Гордеева и др., 2004).

До недавнего времени основным объектом исследования при изучении апоптоза были клеточные линии высших эукариот. Между тем использование дрожжей Saccharomyces cerevisiae в качестве модельного организма значительно удобнее в экспериментальном плане. Половой феромон (-фактор) в высоких концентрациях вызывал программируемую гибель небольшой фракции клеток дрожжей дикого типа (Severin & Hyman, 2002), но при использовании штаммов, сверхчувствительных к половому феромону, практически все клетки, обработанные феромоном, были нежизнеспособны. Такая система открывает широкие возможности для проведения поиска генов, участвующих в регуляции программируемой гибели дрожжей.

Для линий клеток многоклеточных животных в ряде случаев достаточно подробно изучен механизм реализации программы самоубийства, тогда как в случае пекарских дрожжей до сих пор были получены только предварительные сведения, не раскрывающие механизмов этой программы.

Поскольку цитологические и молекулярные признаки программируемой гибели одноклеточных организмов во многом схожи с таковыми для клеток многоклеточных животных, то есть основание полагать, что исследование механизма программируемой гибели дрожжей позволит выявить некоторые общие закономерности апоптоза.

Особый интерес в этой связи представляет собой исследование роли митохондрий в программе самоубийства дрожжевой клетки. Для клеток млекопитающих было показано, что митохондрии играют важную роль в регуляции программы самоубийства. Кроме того, энергетический статус клетки находится в значительной степени предопределяется функциональным состоянием митохондрий. При апоптозе клеток многоклеточных животных митохондрии являются основным источником активных форм кислорода. In vitro было показано, что митохондрии дрожжей также могут образовывать активные формы кислорода (Сhance, 1979).

Однако до сих пор оставалось неизвестным, являются ли митохондрии источником активных форм кислорода (АФК) in vivo. Исследование этого вопроса позволило бы в определенной степени управлять процессом программируемой смерти в одноклеточных организмах.

Понимание механизмов контролируемой клеточной смерти дрожжей имеет значение не только в связи с тем, что позволяет проводить аналогии с апоптозом высших эукариот. Очевидно, что механизмы самоубийства клеток грибов и млекопитающих могут иметь более или менее существенные отличия, на основе этих отличий возможно создание новых специфических антигрибковых препаратов (Philips et al. 2003).

2. Цель и задачи работы Целью данной работы было исследование механизма запрограммированной гибели дрожжей Saccharomyces cerevisiae, вызванной их половым феромоном, а также поиск генов, кодирующих белки, участвующие в распространении или регуляции этого процесса. Особенное внимание предполагалось уделить роли митохондрий, которые в других системах являются ключевыми регуляторами запрограммированной гибели клеток.

В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Провести поиск генов, кодирующих белки, участвующие в распространении каскада самоубийства у дрожжей.

2. Методами флуоресцентной микроскопии определить последовательность внутриклеточных событий, наблюдаемых в ответ на добавление к клеткам дрожжей феромона в высокой концентрации.

2. Провести ингибиторный анализ, определить, на каком этапе каскада действуют различные ингибиторы электронтранспортной цепи, разобщители, антиоксиданты и ингибиторы синтеза белка.

4. Определить роль идентифицированных белков в каскаде самоубийства.

3. Научная новизна Разработана экспериментальная система, в которой добавление неспецифического активатора кальциевых каналов (амиодарона), вызывающая повышение концентрации внутриклеточного кальция, приводит к тем же внутриклеточным событиям (образование АФК, фрагментация ДНК, фрагментация митохондрий и клеточная смерть), что и добавление полового феромона.

Установлена последовательность событий при самоубийстве S.

cerevisiae, вызванной физиологическим фактором - высокой концентрацией полового феромона.

1) Активация МАР-киназного каскада 2) Увеличение концентрации внутриклеточного кальция 3) Гиперполяризация митохондрий 4) Образование митохондриями активных форм кислорода 5) Выход цитохрома с из межмебранного пространства митохондрий 6) Деполяризация и фрагментация митохондрий 7) Гибель клеток Идентифицирован новый белок Ysp1p (Yeast suicide protein), который действует на этапе фрагментации митохондрий. Показано, что образование активных форм кислорода является не побочным проявлением программы самоубийства, вызванной высокой концентрацией феромона, а необходимым этапом. Показано, что феромон-индуцированная гибель дрожжей, также как и апоптоз клеток высших эукариот, сопровождается фрагментацией ядерной ДНК.

4. Научно-практическая ценность Работа имеет теоретическое значение для понимания базовых принципов механизмов реализации апоптотического каскада в различных клетках.

Наличие в одноклеточных организмах физиологической программы самоубийства делает дрожжи не только удобным инструментом для изучения механизмов апоптоза, но также и многообещающей моделью для изучения общих принципов “альтруистической“ смерти организмов.

5. Апробация работы Диссертация апробирована и рекомендована к защите на совместном семинаре отдела биоэнергетики НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского при МГУ имени М.В. Ломоносова и кафедры биохимии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. Материалы диссертации были представлены на международной конференции «Российская биоэнергетика: от молекул к клетке».

6. Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы (7 глав), раздела «Методы исследования» (7 глав), результатов (10 глав), обсуждения и выводов. Диссертация изложена на 157 страницах, содержит 47 рисунков и таблиц. Список литературы включает 222 работы из них 213 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Обзор литературы В обзоре литературы рассмотрено большинство известных к настоящему моменту примеров активной гибели одноклеточных организмов.

Обсуждаются механизмы реализации и регуляции каскада самоубийства у одноклеточных, вызванного различными индукторами. Рассмотрены известные механизмы образования АФК в дрожжах.

2. Материалы и методы В работе были использованы штаммы дрожжей S. cerevisiae W303-1B, W303-1B cmd1-6, W303 cyc3 и W303 -. Кроме этого, в ходе работы были получены несколько штаммов, устойчивых к высоким концентрациям полового феромона, в том числе W303-1B ysp1. Дрожжи выращивали на богатых средах, содержащих в качестве истоника углерода галактозу и раффинозу или, при проведении генетического скрининга, на среде, содержащей в качестве источника углерода глюкозу. Для приготовления твердых сред в указанные выше среды добавляли бакто-агар (20 г/л). Клетки выращивали и инкубировали при температуре 30 С, при этом работали с культурой, находящейся в логарифмической фазе роста.

Программируемую гибель индуцировали половым феромоном (мкг/мл) или амиодароном (80 мкМ). Для определения процента выживания после обработки феромоном или амиодароном, суспензию клеток разводили и высеивали на твердую среду. Через 48 часов подсчитывали количество образовавшихся колоний. В тех случаях, когда процент гибели был низким (менее 40%), выживаемость определяли по окрашиванию метиленовым синим или пропидий иодидом. Образование активных форм кислорода определяли по окрашиванию клеток дихлорфлуоресцеином диацетатом.

Потенциал митохондрий в целых клетках оценивали по флуоресценции тетраметилродамина или потенциалзависимого митотрекера оранжевого.

Для определения скорости дыхания целых клеток и митохондрий использовали полярографический метод.

3. Результаты 3.1. Исследование зависимости гибели клеток от концентрации полового феромона показало, что при концентрации феромона 100 мкг/мл достигается максимальный процент гибели, дальнейшее увеличение концентрации не приводило к увеличению процента мертвых клеток (Рис.1). Для проведения генетического скрининга необходимо было создать систему, где процент выживания клеток не превышал 3-4%. Показано, что фаза клеточного цикла и репликативный возраст клетки не влияли на восприимчивость клеток штамма W303-1B к летальной концентрации полового феромона. Поэтому для проведения генетического скрининга и исследования действия ингибиторов нами был выбран штамм W303-1B cmd1-6, гиперчувствительный к половому феромону. Феромон в концентрации 100 мкг/мл вызывал гибель более 95% клеток (Рис.1).

Количество колониеобразующих единиц (КОЕ) в суспензии клеток штамма W303-1B cmd1-6 через час сокращалось на 20-25%, тогда как окраска прижизненным красителем метиленовым синим не выявляла даже 1% в этот временной интервал. Это наблюдение служит важным подтверждением того, что клетки этого штамма, обработанные -фактором, не лизировались неспецифически, а гибли активным способом.

W303-1B W303-1B cmd1-0 50 100 150 -фактор, мкг/мл Рисунок 1. Зависимость гибели дрожжей штаммов W303 и W303 cmd1-6 от концентрации -фактора.

3.2. Исследовали влияние антиоксидантов: водорастворимого Nацетилцистеина и жирорастворимого -токоферола, а также ингибиторов дыхательной цепи: миксотиазола (ингибитора комплекса III) и KCN (ингибитора цитохромоксидазы), на программируемую гибель клеток штамма W303 cmd1-6, вызванную избытком феромона (Рис.2). Оказалось, что все они в той или иной мере спасали клетки от гибели, однако ингибиторы дыхательной цепи и -токоферол в концентрации 10 мкМ ингибировали и «классический» ответ на феромон, т. е. предотвращали образование половых выростов. Поэтому осталось непонятным, что именно оказывает ингибирующее действие: блокирование дыхательной цепи (в случае с миксотиазолом и KCN) или подавление каких-либо ранних этапов ответа на феромон, возможно, общих для «классического» ответа и феромониндуцируемой гибели.

Число колоний, % Рисунок 2. Влияние антиоксидантов и ингибиторов дыхательной цепи на гибель дрожжей, вызванную феромоном (100 мкг/мл).

3.3 Для дальнейшего изучения молекулярных механизмов самоубийства дрожжей был проведен генетический скрининг генов, кодирующих белки, участвующие в этом каскаде. Для этого был использован штамм W303 cmd16, гиперчувствительный к половому феромону. Мы трансформировали этот штамм транспозоном, который замещал случайный участок последовательности геномной ДНК. Полученную смесь мутантов обрабатывали феромоном и высеивали на твердую среду.

Устойчивость к высокой концентрации феромона могла возникать в следующих случаях: (1) нарушение каскада самоубийства; (2) нарушение общего участка каскада для самоубийства и полового ответа на феромон; (3) потеря функциональных митохондрий (согласно работе Severin & Hyman, 2002); (4) компенсация гиперчувствительности к феромону.

Число колоний, % Контроль KCN, мМ Миксотиазол, мкМ токоферол, мкМ Миксотиазол, 0,мкМ токоферол, 2,мкМ Nацетилцистеин, мМ Список идентифицированных Транспозонная библиотека генов дрожжевого генома Дрожжевая геномная Определение Дрожжевая геномная ДНК ДНК места интеграции транспозона и Обработка рестриктазой NotI нарушенного Дрожжевая Дрожжевая гена геномная amp leu геномная ДНК ДНК Набор фертильных мутантов S. сerevisiae, транспозон устойчивых к высоким Высокоэффективная интегративная концентрациям трансформация штамма S. cerevisiae, фактора (~3%) Гиперчувствительного к -фактору Обработка Набор мутантов S. сerevisiae, –фактором растущих на среде без лейцина (100 мкг/мл) Обработка феромоном Набор фертильных мутантов -фактором (S. сerevisiae, устойчивых к мкг/мл) высоким концентрациям Набор мутантов S. сerevisiae, фактора (~4%) устойчивых к высоким концентрациям Обработка феромона (100%) -фактором (100 мкг/мл) Тест на стерильноcть Набор фертильных мутантов S.

сerevisiae, устойчивых к высоким концентрациям -фактора (~30%) Рисунок 3. Схема генетического скрининга. Проценты в скобках обозначают процент клеток, оставшихся после соответствующего теста. За 100 % принято количество мутантных клеток после первичного теста на устойчивость к феромону.

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»