WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 ||

С целью обнаружить партнёры белка SUUR мы трансформировали клетки штамма SKY191 плазмидой pJK202-SUUR 1-962 и кДНК-библиотекой RFLY(Finley et al., 1996). Последняя представлет собой набор плазмид, кодирующих химерные белки (АД B42)-X, где X может быть любым белком, экспрессирующимся на эмбриональной стадии развития дрозофилы. Всего было получено около 300 тысяч клонов трансформированных дрожжей. Только 96 из них оказались способны расти на селективной среде, лишённой лейцина, и лишь в 12-ти наблюдалась активация транскрипции второго гена-репортёра LacZ.

Из таких клонов мы выделили плазмидные ДНК, произошедшие из кДНКбиблиотеки. Определение последовательности нуклеотидов показало, что плазмид кодируют белок HP1 и 1 плазмида – особую изоформу белка eIF3-S(eIF3-S9-THP23). Одна из плазмид, кодирующих белок HP1 получила название «pJG4-5-HP1 6-206», а плазмида, кодирующая изоформу белка eIF3-S9 – «pJG45-eIF3-S9-THP23».

Далее мы подтвердили специфичность взаимодействия между белками SUUR и HP1 при помощи реципрокного теста. Для этого мы создали плазмиды pJK202-HP1 6-206 и pJG4-5-SUUR 1-962. Первая плазмида позволяет экспрессировать химерный белок (ДСД LexA)-(HP1 6-206) под контролем конститутивного промотора гена ADH1 Saccharomyces cerevisiae, а вторая – химерный белок (АД B42)-(SUUR 1-962) под контролем индуцируемого галактозой (и репрессируемого глюкозой) промотора гена GAL1 Saccharomyces cerevisiae. Только сочетание данных химерных белков в клетках дрожжей приводило к активации экспрессии гена-репортёра LEU2 (Рисунок 7).

Следует отметить, что рост дрожжей в реципрокном тесте был заметно слабее, что, по-видимому, обусловлено умеренным токсическим эффектом химерного белка (ДСД LexA)-(HP1 6-206) – дрожжи, эспрессирующие этот химерный белок, растут существенно медленнее остальных использованных культур даже на неселективной среде.

Картирование доменов, опосредующих взаимодействие между белками SUUR и HP1. С целью прокартировать участок белка SUUR, вовлечённый во взаимодействие с белком HP1, мы сконструировали плазмидные конструкции pJK202-SUUR 1-672, pJK202-SUUR 1-222, pJK202-SUUR 198-338 и pJK202-SUUR 339-671, позволяющие экспрессировать следующие химерные белки: (ДСД LexA)-(SUUR 1-672), (ДСД LexA)-(SUUR 1-222), (ДСД LexA)(SUUR 198-338) и (ДСД LexA)-(SUUR 339-671). Взаимодействие с химерным белком (АД B42)-(HP1 6-206) показали химерные белки (ДСД LexA)-(SUUR 1672) и (ДСД LexA)-(SUUR 339-671). Это позволяет предполагать, что для взаимодействия с белком HP1 необходима и достаточна средняя часть белка SUUR (а.о. 339-671), которая содержит кластеры положительно и отрицательно заряженных а.о., а также сигналы ядерной локализации.

Рисунок 7. Взаимодействие между белками SUUR и HP1 в дрожжевой двугибридной системе. Взаимодействие было исследовано в прямом тесте (первые три ряда) и реципрокном тесте (последние три ряда). Для этого дрожжи, трансформированные указанными плазмидными конструкциями, были выращены в жидкой среде до плотности 2106 кл./мл и затем высеяны серией последовательных разведений (1:1, 1:10, 1:100, 1:1000) на селективную среду, лишённую лейцина и содержащую галактозу. Чашки со средой без лейцина инкубировали 7 суток при 30°C, а чашки со средой, содержащей X-Gal – 4 суток при 30°C. Каждый квадрат представляет собой участок чашки Петри, на который были высеяны дрожжи. При добавлении в селективную среду глюкозы вместо галактозы роста дрожжей обнаружено не было.

С целью прокартировать участок белка HP1, вовлечённый во взаимодействие с белком SUUR, мы использовали полученные ранее плазмидные конструкции pJG4-5-HP1 6-95, pJG4-5-HP1 6-152, pJG4-5-HP1 95206 и pJG4-5-HP1 152-206 (Delattre et al., 2000), позволяющие экспрессировать следующие химерные белки: (АД B42)-(HP1 6-95), (АД B42)-(HP1 6-152), (АД B42)-(HP1 95-206) и (АД B42)-(HP1 152-206). Взаимодействие с химерным белком (ДСД LexA)-(SUUR 1-962) показал только химерный белок (АД B42)(HP1 95-206). Это свидетельствует о том, что для взаимодействия с белком SUUR необходим целый хромотеневой домен а также, возможно, и часть шарнирного домена белка HP1.

Полученные нами данные по взаимодействию между белками SUUR и HP1 подтверждают показанное ранее генетическое взаимодействие между генами SuUR и Su(var)2-5 (Болдырева, 2007).

Известно, что белок HP1 способен димеризоваться и непосредственно взаимодействовать с целым рядом белков, среди которых: SU(VAR)3-7, SU(VAR)3-9, HP2, HP3, HP4, HP5, HOAP и др. В настоящей работе мы установили, что белок HP1 способен взаимодействовать с белком SUUR.

Поскольку один и тот же участок белка HP1 (а.о. 95-206) вовлечён во взаимодействия с белками HP2, HOAP, SU(VAR)3-7, SU(VAR)3-9 и SUUR, то можно предполагать, что последние конкурируют друг с другом за связывание с белком HP1, например, в процессе формирования структуры гетерохроматина.

Особенности взаимодействия между белками SUUR и eIF3-S9-THP23.

Взаимодействие между белками SUUR и eIF3-S9-THP23, обнаруженное в скрининге, характеризовалось рядом особенностей. Во-первых, химерный белок (АД B42)-eIF3-S9-THP23 активировал транскрипцию гена-репортёра LacZ даже в отсутствие химерного белка (ДСД LexA)-(SUUR 1-962). Во-вторых, химерный белок (АД B42)-eIF3-S9-THP23 взаимодействовал с химерными белками (ДСД LexA)-(SUUR 1-962) и (ДСД LexA)-(SUUR 198-338) и не взаимодействовал с промежуточным вариантом – химерным белком (ДСД LexA)-(SUUR 1-672). Эти данные указывают на то, что в одном из экспериментов был получен ложноположительный результат. Таким образом, данные о физическом взаимодействии между белками SUUR и eIF3-S9-THP23 требуют подтверждения в дальнейших экспериментах по генетическому взаимодействию.

Поиск партнёров белка SUUR среди белков-кандидатов. Поскольку нельзя исключить вероятность того, что скрининг выявил не все партнёры белка SUUR, мы провели несколько дополнительных тестов на взаимодействие между белком SUUR и некоторыми белками-кандидатами. В качестве таковых были выбраны белки, для которых имеются косвенные данные, указывающие на их взаимодействие с белком SUUR: CG18563 (взаимодействие с белком SUUR в дрожжевой двугибридной системе «Clontech MatchMaker»; Giot et al., 2003), PC (совместная локализация с белком SUUR в районах интеркалярного гетерохроматина; Zhimulev et al., 2003b), SU(VAR)3-7, SU(VAR)3-(локализация в районах прицентромерного гетерохроматина; Delattre et al., 2000;

Schotta et al., 2002) и SUUR (данные по генетическому взаимодействию;

Kolesnikova et al., 2005).

Для этого были созданы плазмидные конструкции pJG4-5-CG18563 и pJG4-5-PC, позволяющие экспрессировать химерные белки: (АД B42)-CGи (АД B42)-PC. В тестах на взаимодействия были использованы следующие сочетания плазмид: pJK202-SUUR 1-962 и pJG4-5-SUUR 1-962 – для проверки взаимодействия SUUR-SUUR; pJK202-SUUR 1-962 и pJG4-5-CG18563 – для проверки взаимодействия SUUR-CG18563; pJK202-SUUR 1-962 и pJG4-5-PC – для проверки взаимодействия SUUR-PC; pEG202-SU(VAR)3-7 189-844, pEG202SU(VAR)3-7 736-1169 (Delattre et al., 2000) и pJG4-5-SUUR 1-962 – для проверки взаимодействия SUUR-SU(VAR)3-7; pEG202-SU(VAR)3-9 1-569, pEG202SU(VAR)3-9 81-635 (Schotta et al., 2002) и pJG4-5-SUUR 1-962 – для проверки взаимодействия SUUR-SU(VAR)3-9. Результаты всех этих тестов оказались отрицательными.

Поскольку нам не удалось подтвердить ранее открытое взаимодействие между белками SUUR и CG18563 (Giot et al., 2003), вопрос о взаимодействии этих белков остаётся открытым. Возможно, что полученный нами отрицательный результат обусловлен особенностями использованной дрожжевой двугибридной системы «Interaction trap» (Stanyon et al., 2004).

ВЫВОДЫ 1. Построен профиль связывания белка SUUR с хромосомами диплоидных клеток культуры Kc167 Drosophila melanogaster. Точность картирования составила около 2-5 т.п.н.

2. Обнаружена положительная корреляция между распределением белка SUUR в хромосомах диплоидных клеток и уровнем недорепликации ДНК в политенных хромосомах слюнных желёз.

3. Установлено, что распределение белка SUUR в хромосомах положительно коррелирует с распределениями белков гетерохроматина HP1 и SU(VAR)3-9, белков группы Polycomb и белком внутренней ядерной оболочки LAM.

4. Идентифицированы около 3 тысяч генов-мишеней белка SUUR. Показано, что большинство из них сгруппированы в кластеры длиной до 15 генов и реплицируются ближе к концу S-фазы клеточного цикла.

5. Анализ усреднённого паттерна экспрессии генов-мишеней белка SUUR на протяжении онтогенеза дрозофилы показал, что эти гены репрессированы первые 16 часов эмбрионального развития, после чего постепенно активируются, достигая максимальных уровней экспрессии на стадии куколки и у взрослых самцов, и повторно репрессированы у взрослых самок.

6. Установлено, что белок SUUR способен напрямую взаимодействать с белком HP1. Показано, что для данного взаимодействия необходимы и достаточны средняя часть белка SUUR (а.о. 339-504), обогащённая заряженными а.о., и Cконцевая часть белка HP1 (а.о. 95-206), содержащая хромотеневой домен.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Колесникова Т.Д., Андреева Е.Н., Пиндюрин А.В., Ананько Н.Г., Белякин С.Н., Шлома В.В., Юрлова А.А., Макунин И.В., Похолкова Г.В., Волкова Е.И., Заруцкая Е.А., Кокоза Е.Б., Семешин В.Ф., Беляева Е.С., Жимулёв И.Ф. Ген SuUR и его участие в организации эпигенетически репрессированных районов хромосом Drosophila melanogaster // Генетика.

2006. Т.42. № 8. С.1013-1028.

2. Pindyurin A.V., Moorman C., de Wit E., Belyakin S.N., Belyaeva E.S., Christophides G.K., Kafatos F.C., van Steensel B., Zhimulev, I.F. SUUR joins separate subsets of PcG, HP1 and B-type lamin targets in Drosophila // J. Cell Sci. 2007. V.120(14). P.2344-2351.

3. Pindyurin A.V., Boldyreva L.V., Shloma V.V., Kolesnikova T.D., Pokholkova G.V., Andreyeva E.N., Kozhevnikova E.N., Ivanoschuk I.G., Zarutskaya E.A., Demakov S.A., Gorchakov A.A., Belyaeva E.S., Zhimulev I.F. Interaction between the Drosophila heterochromatin proteins SUUR and HP1 // J. Cell Sci.

2008. V.121(10). P.1693-1703.

4. Жимулёв И.Ф., Беляева Е.С., Андреенкова Н.Г., Андреева Е.Н., Белякин С.Н., Болдырева Л.В., Брусенцова И.В., Волкова Е.И., Демаков С.А., Демакова О.В., Заруцкая Е.А., Зыков И.А., Кокоза Е.Б., Колесникова Т.Д., Комор У.А., Коряков Д.Е, Макунин И.В., Пиндюрин А.В., Похолкова Г.В., Семешин В.Ф., Шлома В.В., Юрлова А.А. Ген SuUR – уникальный инструмент для изучения структуры и организации хромосом и генома дрозофилы // Вестник ВОГиС. 2008. Т.12. № 1/2. С.127-148.

5. Andreyenkova N.G., Kokoza E.B., Belyaeva E.S., Demakov S.A., Pindyurin A.V., Semeshin V.F., Andreyeva E.N., Volkova E.I., Zhimulev I.F. Molecular and cytogenetic dissection of the 75C intercalary heterochromatin region in Drosophila melanogaster polytene chromosomes // Chromosoma. в печати.

Pages:     | 1 | 2 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»