WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Картирование участков локализации белка SUUR в хромосомах клеток Kc167. В соответствии с процедурой DamID, мы осуществили трансфекцию клеток культуры Kc167 «контрольной» плазмидой pNDamMyc, а также двумя «экспериментальными» плазмидами pDamMycSUUR и pSUURMycDam. Трансфецированные клетки инкубировали в течение 24 часов при 23.5°C, после чего выделяли геномную ДНК. На следующем этапе выщепляли метилированные фрагменты ДНК из основной массы неметилированной ДНК путём гидролиза эндонуклеазой рестрикции DpnI и амплифицировали после лигирования к их концам специфического олигонуклеотидного адаптера. «Контрольные» и «экспериментальные» образцы метили разными флуоресцентными красителями и гибридизовали на кДНКмикрочипы, содержащие последовательности 11459-и различных кДНК Drosophila melanogaster. Для каждого химерного белка (Dam-SUUR и SUURDam) было выполнено по 4 независимых эксперимента, начиная со стадии трансфекции клеток. Чтобы учесть ошибку гибридизации, вызванную наличием флуоресцентного красителя в составе пробы, в половине экспериментов для мечения «экспериментального» образца использовали флуорохром Cy3, а во второй половине – флуорохром Cy5. Полученные в результате 8-ми экспериментов данные были нормированы и усреднены. Необработанные результаты гибридизаций на кДНК-микрочипы, а также нормированные данные были помещены в базу данных ArrayExpress (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) под идентификационным номером E-MEXP-863.

Отношение «экспериментального» сигнала к «контрольному» сигналу (SUUR~Dam:Dam) было использовано в качестве меры связывания белка SUUR с каждой пробой. Используя ранее описанную модель ошибок (Greil et al., 2003), мы обнаружили, что белок SUUR связывается с 3001-й пробой (далее «генымишени белка SUUR»). Гены-мишени белка SUUR часто располагаются на хромосомах рядом друг с другом (Рисунок 1). Это свидетельствует о том, что белок SUUR, вероятно, связан с протяжёнными районами хромосом.

Рисунок 1. Белок SUUR ассоциирован с протяжёнными кластерами генов. Гистограмма отображает распределение генов-мишеней белка SUUR по кластерам генов разной длины.

Гены-мишени белка SUUR являются преимущественно транскрипционно неактивными и реплицируются ближе к концу S-фазы клеточного цикла. Ранее было показано, что в политенных хромосомах слюнных желёз белок SUUR ассоциирован с районами поздней репликации, в которых располагаются преимущественно транскрипционно неактивные гены (см. обзор Zhimulev et al., 2003a). Чтобы проанализировать транскрипционную активность и время репликации генов-мишеней белка SUUR в клетках культуры Kc167, мы воспользовались соответствующими данными, полученными Шубелером с соавторами (Schubeler et al., 2002). Информация оказалась доступна для примерно одной трети генов-мишеней белка SUUR (для генов).

Результаты проведённого сравнения показали, что только около 30% генов-мишеней белка SUUR активно транскрибируются в клетках культуры Kc167, в то время как среди генов-не-мишеней активно транскрибируются более 70% (Рисунок 2А). Это указывает на то, что белок SUUR связан, в основном, с транскрипционно неактивными генами (статистическая значимость: P = 410-161, гипергеометрический тест). Помимо этого, гены-мишени белка SUUR реплицируются в S-фазе клеточного цикла существенно позднее по сравнению с генами-не-мишенями (статистическая значимость: P = 410-56, тест Вилкоксона по ранжированию сумм) (Рисунок 2Б).

Далее мы сравнили распределение белка SUUR в хромосомах клеток культуры Kc167 с ранее изученными распределениями маркёров активного состояния хроматина: H3-di-meK4, H3-tri-meK4, H3-Ac, H4-Ac и H3-di-K(Schubeler et al., 2002). Информация оказалась доступна для 1034 генов-мишеней белка SUUR. Оказалось, что гены-мишени белка SUUR существенно обеднены наличием перечисленных модификаций гистонов по сравнению с генами-немишенями (статистическая значимость соответственно: P = 910-168, P = 810-152, P = 210-180, P = 110-159 и P = 110-249, тест Вилкоксона по ранжированию сумм) (Рисунок 3А,Б).

Рисунок 2 Гены-мишени белка SUUR преимущественно транскрипционно неактивны, и реплицируются существенно позднее генов-не-мишеней. (А) Белые прямоугольники отображают доли транскрипционно активных генов, а чёрные – доли транскрипционно неактивных генов. (Б) График плотности распределения времени репликации геновмишеней (серая линия) и генов-не-мишеней (чёрная линия) белка SUUR. По оси абсцисс – соотношение количества фрагментов ДНК, реплицированных в первой трети S-фазы клеточного цикла, к количеству фрагментов той же ДНК, реплицированных в последней трети S-фазы, в логарифмическом масштабе. По оси ординат – удельное количество генов в условных еденицах.

Рисунок 3. Гены-мишени белка SUUR обеднены модификациями гистонов H3-di-meK(А) и H3-di-meK79 (Б), характерными для активного состояния хроматина и, напротив, обогащены модификацией H3-tri-meK27 (В), характерной для неактивного состояния хроматина. Графики плотностей распределения модификаций гистонов по генаммишеням (серая линия) и генам-не-мишеням (чёрная линия) белка SUUR. По оси абсцисс – уровень модификации гистона в логарифмическом масштабе. По оси ординат – удельное количество генов в условных еденицах.

Напротив, гены-мишени белка SUUR оказались специфически обогащены H3-tri-meK27 (статистическая значимость: P < 2.210-16, тест Вилкоксона по ранжированию сумм) (Рисунок 3В) – маркёром неактивного состояния хроматина, присутствие которого сопряжено с PcG-зависимой репрессией (Tolhuis et al., 2006). Полученные данные указывают на возможную связь между PcG-зависимой репрессией и присутствием белка SUUR.

Высокая корреляция между распределениями белка SUUR и белков группы Polycomb в хромосомах дрозофилы. Ранее методом иммуноокрашивания политенных хромосом было показано, что белок SUUR и белки группы Polycomb (PcG) имеют высокий процент совместной локализации:

67% сайтов связывания белка SUUR являются одновременно сайтами связывания белков группы Polycomb (Zhimulev et al., 2003b). Это свидетельствует о том, что эти белки могут быть ассоциированы с одними и теми же последовательностями ДНК в геноме дрозофилы. Чтобы проверить эту гипотезу, мы воспользовались недавно опубликованными данными по распределению в хромосомах клеток культуры Kc167 трёх белков группы Polycomb – PC, ESC и SCE (Tolhuis et al., 2006). Проведя сравнительный анализ, мы обнаружили, что профиль связывания белка SUUR с хромосомами действительно положительно коррелирует с таковыми белков PC, ESC и SCE (коэффициент корреляции Спирмана соответственно: = 0.60, = 0.62 и = 0.27). 52% генов-мишеней белка PC (785 генов) и 59% генов-мишеней белка ESC (624 гена) являются также генами-мишенями белка SUUR. С последовательностями 439 генов ассоциированы все три белка (Рисунок 4А).

Умеренная корреляция между распределениями белка SUUR и белков HP1 и SU(VAR)3-9 в хромосомах дрозофилы. Поскольку в политенных хромосомах слюнных желёз значительная доля белка SUUR локализуется в области прицентромерного гетерохроматина, нас интересовало насколько похожими являются профили связывания с хромосомами белка SUUR и белков прицентромерного гетерохроматина в клетках культуры Kc167. Профили связывания белков HP1 и SU(VAR)3-9 были изучены ранее при помощи ДНКмикрочипов, содержащих примерно 6300 проб – кДНК и некодирующие последовательности ДНК (Greil et al., 2003). С целью получить более полную картину связывания белка HP1 с хромосомами клеток Kc167 мы выполнили процедуру DamID, аналогичную описанной выше для белка SUUR, используя «экспериментальную» плазмиду pNDamMycHP1a (van Steensel and Henikoff, 2000). Всего было выполнено 3 независимых эксперимента. Необработанные результаты гибридизаций на кДНК-микрочипы, а также нормированные данные были помещены в базу данных ArrayExpress (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) под идентификационным номером E-MEXP-864. 1094 пробы были идентифицированы как гены-мишени белка HP1.

Сравнительный анализ выявил умеренную положительную корреляцию между профилем связывания белка SUUR с хромосомами и таковыми белков HP1 и SU(VAR)3-9 (коэффициент корреляции Спирмана соответственно: = 0.31 и = 0.46). 46% генов-мишеней белка HP1 (504 гена) и 61% генов-мишеней белка SU(VAR)3-9 (69 генов) являются также генами-мишенями белка SUUR (Рисунок 4Б).

Рисунок 4. Множество генов-мишеней белка SUUR значительно перекрывается со множествами генов-мишеней белков PC, HP1 и LAM, тогда как последние перекрываются незначительно. Диаграммы Венна, отображающие наличие общих генов-мишеней у белков SUUR, PC и ESC (А), SUUR и HP1 (Б), SUUR и LAM (В), PC, HP1 и LAM (Г). В правом нижнем углу каждой диаграммы указано общее число исследованных генов.

Необходимо отметить, что ассоциация белка SUUR с последовательностями ДНК прицентромерного гетерохроматина не исследовалась в данной работе из-за особенностей использованных ДНКмикрочипов. Поэтому полученные нами корреляции распределений белков SUUR и HP1 в хромосомах, равно как и белков SUUR и SU(VAR)3-9, скорее всего, существенно занижены.

Высокая корреляция между распределениями белков SUUR и LAM в хромосомах дрозофилы. Белок LAM (B-type lamin, Lamin Dm0) является важным компонентом внутренней ядерной оболочки. Недавно было изучено его распределение в хромосомах клеток Kc167 (Pickersgill et al., 2006). Это позволило нам провести сравнительный анализ и обнаружить достаточно высокую положительную корреляцию между распределениями белков SUUR и LAM в хромосомах дрозофилы (коэффициент корреляции Спирмана: = 0.51).

71% генов-мишеней белка LAM (330 генов) одновременно являются генамимишенями белка SUUR (Рисунок 4В). Мы также обнаружили что 92% (48 из 52) протяжённых кластеров генов-мишеней белка LAM, прокартированных Пикерсгил с соавторами (Pickersgill et al., 2006), соответствуют ранее картированным районам интеркалярного гетерохроматина в политенных хромосомах слюнных желёз (Zhimulev et al., 2003b). Более того, мы установили, что 24 кластера генов-мишеней белка LAM располагаются в районах, ДНК которых недопредставлена в политенных хромосомах (Belyakin et al., 2005).

Интересно отметить, что множества генов-мишеней белков PC, HP1 и LAM перекрываются незначительно (Рисунок 4Г). Всего 118 генов являются одновременно мишенями для белков SUUR, PC и LAM и лишь 18 – для белков SUUR, HP1 и LAM.

Таким образом, гены-мишени белка SUUR могут быть условно поделены по меньшей мере на четыре неперекрывающиеся подгруппы. Первая и вторая подгруппы ассоциированы соответственно с хорошо изученными белкамирепрессорами PC и HP1. Третья подгруппа образована генами интеркалярного гетерохроматина, располагающимися на периферии ядра. Остальные генымишени белка SUUR (четвёртая подгруппа), вероятно, также ассоциированы с белками гетерохроматина. Таким образом, мы полагаем, что белок SUUR является уникальным маркёром всех типов гетерохроматина у дрозофилы.

Профиль связывания белка SUUR с хромосомами клеток Kcотрицательно коррелирует с профилем недорепликации ДНК политенных хромосом. Ранее Белякиным с соавторами был построен профиль недорепликации ДНК политенных хромосом слюнных желёз (Belyakin et al., 2005). Использовав эти данные, мы обнаружили умеренную отрицательную корреляцию между уровнем политенизации ДНК политенных хромосом и связыванием белка SUUR с хромосомами клеток Kc167 (Рисунок 5).

Рисунок 5. Отрицательная корреляция между профилем связывания белка SUUR с хромосомами клеток культуры Kc167 и профилем политенизации ДНК политенных хромосом слюнных желёз. Приведён фрагмент хромосомы 2L длиной 11.3 м.п.н.

Цитологические районы отмечены над графиком, а координаты исследованных последовательностей ДНК в соответствии с третьей версией аннотации генома Drosophila melanogaster (Celniker et al., 2002) – под графиком. Для построения графика данные были отсортированы согласно их расположению в хромосомах и обработаны с помощью скользящего окна размером 10 генов с шагом в один ген. Данные по политенизации ДНК отображены чёрными точками, а данные по связыванию белка SUUR – серыми. Протяжённые районы недорепликации ДНК (Belyakin et al., 2005) ограничены вертикальными пунктирными линиями и отмечены прямоугольниками с надписью «UR».

Коэффициенты корреляции Пирсона составили -0.368, -0.478, -0.418, 0.320 и -0.352 соответственно для хромосом X, 2L, 2R, 3L и 3R. Это первое наблюдение зависимости степени недорепликацией ДНК от количества присутствующего белка SUUR на молекулярном уровне. Оно хорошо согласуется с полученными ранее результатами, демонстрирующими зависимость степени недорепликации ДНК комплекса Bithorax от дозы гена SuUR (Moshkin et al., 2001; Zhimulev et al., 2003b).

Активность генов-мишеней белка SUUR в онтогенезе дрозофилы. Мы проанализировали транскрипционную активность генов-мишеней белка SUUR в развитии Drosophila melanogaster, используя соответствующие ранее опубликованные данные (Arbeitman et al., 2002). Информация оказалась доступна для 744 генов-мишеней белка SUUR. Оказалось, что эти гены-мишени белка SUUR в среднем транскрипционно неактивны на эмбриональной стадии развития. На последующих стадиях они постепенно активируются и достигают максимального уровня экспрессии у взрослых самцов, в то же время у взрослых самок они снова транскрипционно неактивны (Рисунок 6). Ранее было установлено, что похожим образом экспрессируются гены, которые располагаются в 52-х районах, характеризующихся недорепликацией ДНК в политенных хромосомах слюнных желёз (Belyakin et al., 2005).

Рисунок 6. Белок SUUR ассоциирован с генами, репрессированными на эмбриональной стадии развития. Приведены усреднённые значения экспрессии 744 генов-мишеней белка SUUR на протяжении онтогенеза дрозофилы. «Э» – эмбриональная стадия развития, «Л» – личиночная стадия, «К» – стадия куколки, «И» – взрослые самцы, «И» – взрослые самки. Чёрные прямоугольники обозначают этапы развития, на которых обнаруживается существенная разница в экспрессии между генами-мишенями и генами-не-мишенями белка SUUR (статистическая значимость: P < 0.01, тест Вилкоксона по ранжированию сумм с поправкой Бонферрони).

Поиск партнёров белка SUUR с помощью скрининга кДНКбиблиотеки. Чтобы найти партнёров белка SUUR с помощью метода дрожжевой двугибридной системы «Interaction trap», необходимо экспрессировать в клетках Saccharomyces cerevisiae соответствующую «приманку» – химерный белок (ДСД LexA)-(SUUR 1-962), состоящий из ДСД белка LexA и полноразмерного белка SUUR (a.о. 1-962), и «добычу» – химерный белок, состоящий из АД белка B42 и тестируемого белка-партнёра. С этой целью мы создали плазмидную конструкцию pJK202-SUUR 1-962, позволяющую экспрессировать химерный белок (ДСД LexA)-(SUUR 1-962) под контролем конститутивного промотора гена ADH1 Saccharomyces cerevisiae.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»