WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

Пиндюрин Алексей Валерьевич БЕЛОК SUPPRESSOR OF UNDERREPLICATION DROSOPHILA MELANOGASTER: РАСПРЕДЕЛЕНИЕ В ХРОМОСОМАХ И ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ДРУГИМИ БЕЛКАМИ Генетика – 03.00.15

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК Новосибирск 2008

Работа выполнена в отделе молекулярной и клеточной биологии Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.

Научный консультант: доктор биологических наук

, профессор, академик Жимулёв Игорь Фёдорович Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Меркулова Татьяна Ивановна доктор биологических наук, профессор Стегний Владимир Николаевич Ведущее учреждение: Институт биологии гена РАН, г. Москва

Защита диссертации состоится 3 декабря 2008 года на утреннем заседании диссертационного совета Д-003.011.01 в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Иститута по адресу:

проспект акад. Лаврентьева 10, г. Новосибирск, 630090.

тел/факс: (383)3331278, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан _ 2008 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук А.Д. Груздев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Одной из актуальных проблем современной генетики является изучение механизмов, контролирующих процессы репликации, экспрессии и репрессии генов. В последние годы, благодаря расшифровке геномов эукариот и разработке новых экспериментальных подходов, исследования этой проблемы вышли на уровень генома. В частности, активно ведутся работы по изучению времени репликации большого количества генов, а также их транскрипционной активности на разных стадиях развития, в разных тканях и под влиянием различных факторов. Регулярно появляются новые данные по картированию с высокой точностью участков локализации специфических белков и модификаций гистонов в хромосомах клеток разных типов.

Особый интерес представляет исследование гетерохроматина, отличающегося высоким уровнем компактизации ДНК, конденсированным состоянием на протяжении всего клеточного цикла, низким уровнем транскрипционной активности, ассоциацией с ядерной мембраной, поздним временем репликации в S-фазе клеточного цикла, а также наличием специфических негистоновых белков и особых модификаций гистонов (см.

обзор Craig, 2005). Такое репрессированное состояние хроматина устанавливается на ранних этапах развития организма и в дальнейшем наследуется на протяжении многочисленных клеточных делений (так называемое «эпигенетическое наследование»). У Drosophila melanogaster – одного из модельных объектов для генетических исследований – около 30% генома формирует гетерохроматин, который локализован в прицентромерных областях хромосом (прицентромерный гетерохроматин), в районах теломер (теломерный гетерохроматин), а также в многочисленных сайтах, рассеянных вдоль эухроматиновых плеч хромосом (интеркалярный гетерохроматин).

Прицентромерный гетерохроматин содержит относительно мало генов и представлен средне- и высокоповторёнными последовательностями ДНК (см.

обзор Wallace and Orr-Weaver, 2005), а районы интеркалярного гетерохроматина соответствуют кластерам уникальных неактивных генов (Belyakin et al., 2005).

Молекулярную основу эпигенетически наследуемого репрессированного состояния гетерохроматина составляет прежде всего особый набор модификаций коровых гистонов, с которыми связываются специфические негистоновые белкирепрессоры.

Отличительной особенностью гетерохроматиновых районов у дрозофилы является недорепликация (недопредставленность) ДНК в политенных хромосомах слюнных желёз. Единственным известным фактором, специфически влияющим на недорепликацию ДНК гетерохроматиновых районов, является ген Suppressor of UnderReplication (SuUR) (Belyaeva et al., 1998). Мутация данного гена приводит к полному подавлению недорепликации ДНК в интеркалярном гетерохроматине и частичному подавлению недорепликации в прицентромерном гетерохроматине, а дополнительные трансгенные копии нормального аллеля гена SuUR, напротив, вызывают усиление недорепликации ДНК (см. обзор Zhimulev and Belyaeva, 2003). Методом флуоресцентного иммуноокрашивания политенных хромосом белок SUUR был обнаружен в районах прицентромерного, интеркалярного и теломерного гетерохроматина, а также в ядрышке. Однако, механизм его воздействия на процесс политенизации ДНК гетерохроматиновых районов пока не известен.

Цель и задачи Целью данной работы является построение и последующее изучение профиля связывания белка SUUR с хромосомами культуры клеток эмбрионов Drosophila melanogaster, а также поиск белков, взаимодействующих с белком SUUR. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Выполнить картирование участков локализации белка SUUR на хромосомах культуры клеток эмбрионов дрозофилы посредством процедуры DamID (Dam Identification) в сочетании с технологией кДНК-микрочипов. Построить профиль связывания белка SUUR с хромосомами. Провести сравнительный анализ локализации белка SUUR в хромосомах и определить состояние транскрипционной активности его генов-мишеней с использованием ранее опубликованных данных.

2. Исследовать наличие взаимодействий между белком SUUR и основными негистоновыми белками гетерохроматина (HP1, PC и др.) с помощью метода дрожжевой двугибридной системы.

Научная новизна В настоящей работе впервые осуществлено картирование участков локализации белка SUUR на хромосомах диплоидных клеток Drosophila melanogaster. Впервые участки локализации этого белка на хромосомах были выявлены в геномном масштабе с высокой степенью точности (порядка 2-т.п.н.). Установлена положительная корреляция между распределением белка SUUR и уровнем недорепликации ДНК в политенных хромосомах слюнных желёз. Выявлен первый непосредственный партнёр белка SUUR – белок HP1.

Установлено, что для взаимодействия между этими двумя белками необходимы и достаточны средняя заряженная часть белка SUUR и C-концевая часть белка HP1, содержащая хромотеневой домен.

Научно-практическая значимость исследования Результаты данной работы способствуют расширению фундаментальных знаний о компонентах хроматина, контролирующих процессы репликации и транскрипционной активности генов. Впервые обнаружено и охарактеризовано прямое физическое взаимодействие белка SUUR с другим белком гетерохроматина, а именно белком HP1. Полученные данные важны для понимания особенностей процесса репликации в районах гетерохроматина.

Помимо этого, в данной работе выполнено полномасштабное картирование белков SUUR и HP1 и сравнительный анализ распределения этих и ряда других белков хроматина в хромосомах Drosophila melanogaster. В настоящее время эти данные активно используются в биоинформационных исследованиях, посвящённых картированию и предсказанию функционально значимых белковых кластеров в хромосомах Drosophila melanogaster.

Материалы данной диссертационной работы используются в курсах лекций для студентов биологических факультетов ряда вузов.

Апробация работы Основные результаты данной работы были представлены на: семинаре ВОГиС «Актуальные проблемы генетики и селекции», 30 ноября 2005 г., Новосибирск, Россия; международной конференции «Физико-химическая биология», посвященной 80-летию со дня рождения академика Д.Г. Кнорре, июля – 3 августа 2006 г., Новосибирск, Россия; международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии», 9 – 12 мая 2007 г., Томск, Россия; 8-ой международной конференции по гетерохроматину, 3 – 9 июня 2007 г., Губбио, Италия; международной конференции «Развитие эволюционной идеи в биологии, социологии и медицине», посвященной 90-летию со дня рождения академика Д.К. Беляева, 7 – 9 августа 2007 г., Новосибирск, Россия; международной конференции «ДНК репликация и поддержание генома у эукариот», 5 – 9 сентября 2007 г., Колд Спринг Харбор, США; 20-ой европейской конференции по исследованию дрозофилы, 12 – 14 сентября 2007 г., Вена, Австрия; II Съезде Общества клеточной биологии совместно с Юбилейной конференцией, посвященной 50летию Института цитологии РАН, 16 – 19 октября 2007 г., Санкт-Петербург, Россия.

Публикации По теме диссертации опубликовано или находится в печати 5 работ.

Структура и объём диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, а также выводов и списка цитируемой литературы, в который входит 288 ссылок. Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы, 24 рисунка и приложения на 29 страницах.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы Штаммы Saccharomyces cerevisiae. В работе были использованы ауксотрофные по гистидину, лейцину, триптофану и урацилу штаммы Saccharomyces cerevisiae EGY48 (MAT, ura3, his3, trp1, LexAop(6)-LEU2), SKY473 (MATa, ura3, his3, trp1, LexAop(4)-LEU2, cI(3)-LYS2) и SKY191 (MAT, ura3, his3, trp1, LexAop(2)-LEU2, cI(3)-LYS2).

Культуры клеток Drosophila melanogaster. В работе были использованы культуры клеток Kc167 и S2, полученные из эмбриональных тканей Drosophila melanogaster (Echalier, 1997).

Плазмиды и кДНК-библиотека. В работе были использованы плазмидные векторы pNDamMyc, pCMycDam (van Steensel and Henikoff, 2000), pEG202, pJK202 и pJG4-5 (Golemis et al, 2002); плазмиды f40 (Makunin et al., 2002), pNDamMycHP1a (van Steensel and Henikoff, 2000), pCSu(var)3-9MycDam (Greil et al., 2003), pJG4-5-HP1 6-95, pJG4-5-HP1 6-152, pJG4-5-HP1 95-206, pJG45-HP1 152-206, pEG202-SU(VAR)3-7 189-844, pEG202-SU(VAR)3-7 736-(Delattre et al., 2000), pEG202-SU(VAR)3-9 1-569, pEG202-SU(VAR)3-9 81-(Schotta et al., 2002) и кДНК-библиотека RFLY1 (Finley et al., 1996).

Антитела. В работе были использованы мышиные моноклональные антитела 9E10 к эпитопу Myc (Abcam, http://www.abcam.com/) и козьи поликлональные FITC-конъюгированные антитела к IgG мыши (Sigma-Aldrich, http://www.sigmaaldrich.com/).

кДНК-микрочипы. В работе были использованы кДНК-микрочипы, содержащие последовательности 11459 кДНК Drosophila melanogaster (Rubin et al., 2000; Stapleton et al., 2002).

Методики работы с рекомбинантной ДНК. В работе использовали стандартные методы расщепления ДНК эндонуклеазами рестрикции, электрофореза ДНК в агарозных гелях, конструирования рекомбинантных молекул ДНК, подготовки и последующей трансформации компетентных клеток Escherichia coli, наработки и выделения плазмидной ДНК. Нуклеотидные последовательности всех использованных в работе плазмид были проверены посредством секвенирования при помощи соответствующих праймеров и реактива «ABI PRISM Big Dye Terminator v3.0 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit» (Applied Biosystems, http://www.appliedbiosystems.com/) в межинститутском центре секвенирования ДНК (ИХБиФМ СО РАН).

Процедура DamID. Процедуру DamID, состоящую из серии трансфекций клеточной культуры набором плазмид, иммуноокрашивания клеток антителами к эпитопу Myc, выделения и амплификации метилированных фрагментов ДНК, выполняли в соответствии с ранее описанными протоколами (van Steensel and Henikoff, 2000; Greil et al., 2006).

Работа с дрожжевой двугибридной системой «Interaction trap».

Трансформацию клеток Saccharomyces cerevisiae плазмидной ДНК, тесты на ДНК-связывающую активность химерных белков, содержащих ДНКсвязывающий домен (ДСД) LexA, а также тесты на активацию генов-репортёров LEU2 и LacZ выполняли в соответствии со стандартными протоколами (Becker and Lundblad, 2002; Golemis et al., 2002).

Результаты и обсуждение Локализация химерных белков Dam-SUUR и SUUR-Dam в клетках дрозофилы. Поскольку присоединение дополнительных аминокислотных остатков (а.о.) к N- или C-концу нативного белка (образование химеры) может привести к нарушению функции последнего, в наших экспериментах по картированию участков локализации белка SUUR в хромосомах клеток дрозофилы мы использовали две плазмидные конструкции: pDamMycSUUR и pSUURMycDam. Первая плазмидная конструкция кодирует химерный белок Dam-Myc-SUUR (Dam-Myc), а вторая – химерный белок SUUR-Myc-Dam (SUUR-Dam), где Myc – это эпитоп Myc. В каждом случае экспрессия химерного белка находится под контролем промотора гена теплового шока hspDrosophila melanogaster.

В отсутствие теплового шока (при температуре 23.5°C) промотор гена hsp70 обеспечивает в клетках дрозофилы очень низкий уровень транскрипции, что является необходим условием для успешного выполнения эксперимента DamID. Как следствие, при таких условиях невозможно детектировать химерные белки ни с помощью Вестерн-блот анализа, ни посредством иммуноокрашивания (van Steensel and Henikoff, 2000; Greil et al., 2006). С целью убедиться, что химерные белки Dam-SUUR и SUUR-Dam могут нарабатываться и локализоваться в ядрах трансфецированных клеток Kc167, мы подвергли клетки кратковременному тепловому шоку (1 час при 37 С), дали им возможность восстановиться (5 часов при 23.5°C), после чего осуществили иммуноокрашивание антителами к эпитопу Myc.

Оказалось, что оба химерных белка (Dam-SUUR и SUUR-Dam) локализуются в клетках сходным образом. Они обнаруживаются исключительно в ядрах, причём наиболее интенсивные сигналы наблюдаются в районах хромоцентров (прицентромерного гетерохроматина). В то же время химерный белок Dam-Myc (Dam) присутствует как в ядрах, так и в цитоплазме клеток, что хорошо согласуется с литературными данными (van Steensel and Henikoff, 2000).

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»