WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 ||

Для проверки данного утверждения мы провели прямые измерения сигнала флуоресценции от отдельных окрашенных митохондрии в суспензии методом ФКС.

А Б Рис.9. А – Временная зависимость интенсивности флуоресценции суспензии митохондрий, окрашенных сафранином О (10 мкМ). 1 - 10 мкМ сафранина О в буфере, 2 - добавка митохондрий 0,39 мг/мл, ротенон 1 мкМ, 3 - добавка сукцината 5 мМ, 4 - добавка ДНФ 100 мкМ Б – Зависимость площади под пиками в энергизованном (кривая 1) и деэнергизованном (кривая 2) состоянии в присутствии различных концентраций сафранина О. Условия: митохондрии 0,мг/мл, ротенон 1 мкМ, сукцинат 5 мМ (кривая 1). Деэнергизованное состояние измерялось в присутствии ДНФ (100 мкМ).

На рис.9А показаны временные зависимости интенсивности флуоресценции красителя в присутствии митохондрий в различных энергетических состояниях.

Для количественной характеристики взаимодействия сафранина О с митохондриями на микроуровне вычислялась общая площадь под пиками в записи флуоресценции в присутствии различных концентраций красителя по формуле S = (F(t) - F0 ) (рис.9Б). Было показано, что в случае высокой начальной концентрации сафранина О (10 мкМ) энергизация не приводит к увеличению яркости отдельных частиц. Из этого можно сделать вывод, что видимое падение сигнала флуоресценции на макроуровне действительно связано с уменьшением концентрации свободного красителя в растворе и накоплением его в митохондриях в концентрации самотушения. При использовании сафранина О в концентрации 1 мкМ энергизация митохондрий приводила к появлению пиков высокой амплитуды и увеличению общей площади под пиками по сравнению с деэнергизованным состоянием.

Изучение функциональных свойств порина внешней мембраны выделенных митохондрий на уровне одиночных частиц.

Транспорт гидрофильных компонентов в митохондрии осуществляется АТФ-Bodipy через специальные белковые каналы в мембранах. Преобладающим по массе канальным белком внешней мембраны митохондрий является порин. В нашей работе метод ФКС был применен для изучения функционального состояния порина по накоплению флуоресцентно меченого АТФ (АТФ-Bodipy) отдельными митохондриями в суспензии выделенных органелл. Большое число АТФ-связывающих центров внутри митохондрий обеспечивает высокую специфичность связывания АТФ-Bodipy.

Контрольные опыты показали, что такой гидрофильный низкомолекулярный краситель как сульфородамин Б не накапливался в митохондриях. Свойства порина ранее изучались электрофизиологическими и биохимическими методами. Мы впервые исследовали действие известных модуляторов поринового канала (НАД+, НАДН, полианион Кёнига, гексокиназа) на его функциональное состояние в митохондриях в физиологических условиях. На рис.10А показана зависимость числа событий N(F>F0) от амплитуды пиков для суспензии неэнергизованных митохондрий с открытым каналом порина, предварительно проинкубированных со специфическим искусственным ингибитором канала полианионом Кёнига.

Предварительная инкубация суспензии митохондрий с выделенной и очищенной митохондриальной гексокиназой также приводила к ингибированию входа меченого АТФ (рис.10Б). ), вследствие, по-видимому, ассоциации гексокиназы с порином. Однако в отличие от необратимого действия других модуляторов, действие фермента было обратимым при добавлении глюкозо-6-фосфата, что явно обусловлено диссоциацией фермента.

Таким образом, наши данные показали, что связывание гексокиназы приводит к блокированию транспорта АТФ через пориновый канал.

А Б Рис.10 А - Зависимость числа событий N(F>F0) от амплитуды пиков флуоресценции суспензии митохондрий в присутствии АТФ-Bodipy: действие полианиона Кёнига. 1 – митохондрии 0,04 мг/мл, ротенон 2 мкМ, АТФ-Вodipy 25 нМ, 2 – митохондрии 0,04 мг/мл, ротенон 2 мкМ, 0,06 мг/мл полианион Кёнига, АТФ-Вodipy 25 нМ, 3 – добавка 0,1 мг/мл аламетицина, 4 – добавка мМ АТФ. Б – Зависимость числа событий от амплитуды пиков суспензии митохондрий в присутствии АТФ-Bodipy: действие гексокиназы. 1 – митохондрии 0,04 мг/мл, ротенон 2 мкМ, АТФ-Вodipy 25 нМ, 2 – митохондрии 0,04 мг/мл, ротенон 2 мкМ, гексокиназа 0,27 мг/мл, АТФ-Вodipy 25 нМ, кривая 3 – добавка 1 мМ глюкозо-6-фосфат.

Было показано, что НАДН также подавляет активность канала, тогда как его окисленная форма НАД+ действует значительно слабее (данные не приведены). Результаты изучения действия перечисленных модуляторов на транспорт АТФ через канал хорошо коррелируют с электрофизиологическими данными по ионной проницаемости порина.

Выводы 1. На основе метода флуоресцентной корреляционной спектроскопии, суть которого состоит в измерении флуктуаций флуоресценции от микрообъема, составляющего несколько фемтолитров, разработан модифицированный экспериментальный подход, названный методом анализа амплитуд пиков (ААП) флуоресценции суспензии окрашенных частиц. Метод ААП позволяет оценить два основных параметра системы: яркость частицы и концентрацию флуоресцирующих частиц в суспензии. Выведено аналитическое выражение для вычисления яркости одиночной частицы и параметра, пропорционального числу флуоресцирующих частиц в суспензии.

2. Метод ААП опробован на модельной системе, содержащей гомогенные по яркости и размеру флуоресцентные сферы (типичный размер 500 нм).

3. Показано, что метод ААП позволяет исследовать свойства отдельных митохондриальных частиц или их малых ансамблей. Разработанный подход применен для анализа функционального состояния выделенных митохондрий.

С помощью анализа флуоресценции суспензии выделенных митохондрий, окрашенных потенциалзависимым флуоресцентным красителем, этиловым эфиром тетраметилродамина (ТМРЭ), измерен мембранный потенциал митохондрий, а также число частиц в миллиграмме белка. Преимущество данного подхода перед традиционными методами измерения мембранного потенциала состоит в том, что он позволяет проводить измерения при наличии менее 1 мкг белка в пробе, что делает доступным изучение митохондрий, выделенных из культур клеток.

4. Прямыми измерениями флуоресценции суспензии энергизованных митохондрий, окрашенных потенциалзависимым красителем сафранином О, показано уменьшение концентрации молекул флуорофора в растворе и накопление их в митохондриальных частицах в концентрации самотушения.

При более низких концентрациях сафранина О энергизация митохондрий приводила к увеличению интенсивности флуоресценции отдельных частиц в согласии с результатами, полученными с использованием красителя ТМРЭ.

5. Метод ААП позволил исследовать влияние различных модуляторов порина внешней мембраны митохондрий на вход флуоресцентно меченного АТФ в интактные органеллы в физиологических условиях. Показано, что наличие большого числа АТР-связывающих центров внутри митохондрий обеспечивает накопление флуоресцентно меченного АТФ внутри органелл в высоких концентрациях. Показано также, что связывание фермента гексокиназы приводит к блокированию транспорта АТФ через пориновый канал.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Perevoshchikova I.V., Zorov D.B. Antonenko Y.N. Peak intensity analysis as a method for estimation of fluorescent probe binding to artificial and natural nanoparticles: Tetramethylrhodamine uptake by isolated mitochondria. Biochim.

Biophys. Acta - Biomembranes, 1778 (10), 2182-2190, 2008.

2. Перевощикова И.В., Сорочкина А.И., Зоров Д.Б., Антоненко Ю.Н.

Сафранин О как флуоресцентный индикатор мембранного потенциала митохондрий: исследование на уровне суспензии и уровне отдельных митохондрий, Биохимия, 74 (6), 663-671, 3. Пашковская A.A., Перевощикова И.В., Майзлиш В.Е., Шапошников Г.П., Котова E.A., Антоненко Ю.Н. Взаимодействие тетразамещенного катионного фталоцианина алюминия с искусственными и природными мембранами.

Биохимия, 74 (9), 1252-1259, 4. Perevoshchikova I.V., Zorov D.B., Novoderezhkin V.I., Antonenko Y.N. Peak amplitude analysis as a simplified version of the method of photon counting histogram for estimation of binding of a probe to artificial and natural nano-particles.

Abstracts of the 52th Annual Biophysical Society Meeting, Long Beach (USA), Biophys. J., 94, 1584, 2008.

5. Perevoshchikova I.V., Zorov D.B, Antonenko Y.N. Brightness analysis of isolated mitochondria doped with TMRE and Mitotracker. Abstracts of the 6th EBSA European Biophysics Congress, London (U.K.), Eur. Biophys. J., 36, S22, 2007.

6. Perevoshchikova I.V., Zorov D.B., Antonenko Y.N. Fluorescently-labeled ATP as a probe of the outer mitochondrial membrane barrier: role of VDAC.

Abstracts of the 7th European Biophysics Congress, Genova (Italy), Eur. Biophys. J., 38, 201, 2009.

Pages:     | 1 | 2 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»