WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

этиловый эфир тетраметилродамина (ТМРЭ), сафранин О, родамин 123, митотрекер красный. Время диффузии митохондрий в энергизованном состоянии, окрашенных ТМРЭ, составило d=0,067±0,009 с, коэффициент диффузии D=0,69 мкм2/с, что, исходя из сферической формы частицы и с учетом вязкости буферного раствора сахарозы, дает величину радиуса R=0,мкм. Было показано, что подвижность митохондрий в энергизованном и неэнергизованном состоянии близка (добавка субстрата дыхательной цепи сукцината не оказывает значительного влияния на величину d). Кроме того, оказалось, что в условиях свободной диффузии таких крупных объектов как митохондрии, за типичное время измерения (30 с) регистрируется число событий, недостаточное для точной статистической обработки. Поэтому основные параметры автокорреляционной функции (время диффузии и число частиц в конфокальном объеме) варьируют даже в идентичных экспериментальных условиях. Следует учесть, что в случае таких объектов, как выделенные митохондрии, которые быстро теряют функциональную активность, точность измерений невозможно повысить за счет длительного накопления данных. Таким образом, традиционный способ анализа данных, полученных методом ФКС, не может быть применен в случае суспензии митохондрий. Однако, в наших экспериментах было замечено, что амплитуда флуктуаций флуоресценции митохондрий, окрашенных ТМРЭ, значительно различается в зависимости от их энергетического состояния и, следовательно, может быть использована для оценки его главной характеристики, а именно, мембранного потенциала, на уровне отдельной митохондрии. Поскольку амплитуда флуктуаций интенсивности флуоресценции не должна зависеть от размера частиц, а определяется, при постоянных технических характеристиках прибора, числом молекул флуорофора на одну частицу, было предложено использовать этот параметр в качестве критерия взаимодействия потенциалзависимых флуоресцентных красителей с митохондриями.

Анализ зависимостей интенсивности флуоресценции от времени для суспензии митохондрий, окрашенных ТМРЭ.

На рис.3А показана временная зависимость интенсивности флуоресценции красителя ТМРЭ, которая в данном масштабе представляет собой прямую линию (кривая 1, рис.3А). Добавление митохондрий (неэнергизованное состояние) в раствор ТМРЭ приводит к появлению в записи флуоресценции пиков небольшой амплитуды, вследствие, по-видимому, неспецифической сорбции молекул красителя на поверхности митохондрий (кривая 2, рис.3А). Последующее добавление сукцината приводит к существенному увеличению амплитуды пиков, которое, очевидно, вызвано энергозависимым входом флуоресцентных молекул внутрь митохондрий в ответ на генерацию мембранного потенциала (кривая 3, рис.3А). Последующее добавление ДНФ приводит к падению числа и амплитуды пиков, связанному с выходом красителя из митохондрий при переходе в деэнергизованное состояние (кривая 4, рис.3А).

Для получения статистически достоверной оценки параметров системы необходимо увеличивать время измерения. Однако, длительное воздействие лазерного излучения может привести к выцветанию молекул флуорофора и разобщению митохондрий вследствие фотодинамического действия. Поэтому для увеличения числа событий без увеличения продолжительности измерений мы применили перемешивание суспензии митохондрий, которое не влияет на амплитуду флуктуаций флуоресценции.

Б Рис.3. А - зависимость интенсивности флуоресценции от времени для суспензии митохондрий, окрашенных ТМРЭ 0,3 мкМ, в отсутствие перемешивания. 1 – контрольная запись в растворе ТМРЭ, 2 – неэнергизованное состояние, митохондрии 0,4 мг/мл, ротенон 3 мкМ, 2 – энергизованное состояние, добавка сукцината 5 мМ, 3 – деэнергизованное состояние, добавка ДНФ 100 мкМ. Б – схематическое представление цепи событий взаимодействия красителя ТМРЭ с отдельной митохондрией в различных энергетических состояниях.

На рис.4А приведены зарегистрированные в условиях перемешивания временные зависимости интенсивности флуоресценции суспензии митохондрий, окрашенных ТМРЭ. На рис.4Б приведены соответствующие гистограммы распределения интенсивностей флуоресценции для записей, изображенных на рис.4А. Из сравнения данных, представленных на рис.3А и 4А, видно, что перемешивание значительно увеличило число регистрируемых событий, тогда как качественный эффект увеличения числа и амплитуды пиков флуоресценции при энергизации митохондрий сохранился. Гистограмма распределения интенсивностей флуоресценции показывает вероятность нахождения частицы с определенной яркостью в конфокальном объеме. Так как энергизация приводит к увеличению яркости отдельных частиц, на гистограмме 2 (рис.4Б) появляется соответствующее правое плечо высоких интенсивностей флуоресценции.

Пики флуоресценции имеют большой разброс по амплитуде даже в случае одинаковых по яркости флуоресцирующих сфер (рис.2А).

А Рис.4. А – зависимость интенсивности флуоресценции от времени для суспензии митохондрий, окрашенных ТМРЭ (0,03 мкМ), в условиях перемешивания. 1 – митохондрии 0,26 мг/мл, ротенон 7 мкМ, 2 – добавка сукцината 7 мМ, 3 – добавка ДНФ 100 мкМ. Б – гистограмма распределения интенсивностей флуоресценции для условий рис.4А Это связано с существенно неоднородной освещенностью конфокального объема. Поэтому для определения яркости отдельных митохондрий в суспензии мы разработали метод анализа амплитуд пиков флуоресценции, который позволяет вычислять интенсивность флуоресценции единичной частицы, проходящей через центр области освещения, где интенсивность лазерного возбуждения максимальна.

Вывод аналитического выражения для определения яркости частицы, проходящей через центр конфокального объема.

Аналитическое выражение функции распределения интенсивности флуоресценции для точечных частиц одинаковой светимости B(пропорциональной коэффициенту экстинкции и квантовому выходу флуоресценции красителя) было получено в предположении, что вероятность обнаружения частицы в конфокальном объеме описывается функцией Гаусса в трехмерном пространстве. Тогда максимальная яркость движущейся частицы определяется по уравнению (3):

F = B0 A exp(-2r2 / r02) exp(-2z2 / z0 ), (3) где А – максимальная интенсивность света в центре конфокального объема, r, z – координаты точки максимального сближения с центром конфокального объема.

Доля событий, для которых амплитуда больше F0, т.е. P(F>F0), составит FP(F > F0) = -P0 ln( ) для F0 < A B0 и P(F > F0) = 0 для F0 > A B0 (4) A Bгде P0 – нормировочный множитель, пропорциональный концентрации частиц.

Экспериментально измерялась не вероятность обнаружения событий с амплитудой больше заданного порога, а число таких событий. При этом такое число событий N(F>F0) прямо пропорционально P(F>F0). Рассмотрим производную функции P(F>F0), характеризующую количество событий, происходящих в интервале около F=F0, которую можно получить из уравнения (4) дифференцированием:

dP(F > F0 ) P= dF0 FКак было показано в литературе, функция Гаусса в трехмерном пространстве хорошо описывает распределение интенсивности света в области фокусировки в случае двухфотонного лазерного источника возбуждающего света. В нашей оптической схеме используется однофотонный лазер, для которого функция распределения вероятности обнаружения частицы в конфокальном объеме описывается комбинацией функций Гаусса и Лоренца. В некоторых случаях данная функция распределения в конфокальном объеме хорошо описывается функцией Лоренца в трехмерном пространстве:

F = B0 A 1+ r2 / r02 + z2 / zТогда функция P(F>F0) и ее производная равны:

A BP(F > F0) = P0 ( -1) ; для F0 < A B0, и P(F > F0) = 0 для F0 > A B0 (5) FdP(F > F0 ) P0 A B= dFF0 Функции распределения (4) и (5) были использованы для аппроксимации экспериментальных данных для флуоресцентных сфер. Оказалось, что уравнение (4) явно завышает число событий N(F>F0), а уравнение (5) занижает.

Однако сходная функция (6) хорошо описывает данные:

A BP(F > F0) = P0 ( -1) для F0 < A B0, и P(F > F0) = 0 для F0 > A B0 (6) FP0 A BУравнение (6) было получено путем интегрирования функции, которая F1.P0 P0 A Bявляется промежуточной между и.

F0 F0 Уравнение (6) дает информацию о двух важных параметрах системы: яркости частицы, проходящей через центр конфокального объема, А·В0, и величине Р0, пропорциональной концентрации частиц в суспензии.

Проверка аналитического выражения на модельных системах (метод ААП).

Для оценки применимости предложенного выше подхода были проанализированы временные зависимости интенсивности флуоресценции суспензий гомогенных по яркости флуоресцирующих сфер различного размера.

Рис.5А показывает, что с увеличением диаметра яркость частицы возрастает.

Это хорошо согласуется с информацией о зависимости яркости от размера, предоставленной производителем.

Мы также измерили зависимость числа событий N(F>F0) от амплитуды пиков для более сложной системы: нефлуоресцирующих сфер, проинкубированных с ТМРЭ в различной концентрации. На вставке к рис.5Б видно, что параметр А·В0 линейно растет с увеличением концентрации ТМРЭ, что отражает сорбцию молекул красителя на поверхность латексных частиц.

Таким образом, полученное аналитическое выражение хорошо описывает основные свойства изучаемой системы.

А Б ТМРЭ, нМ Амплитуда пиков, кГц Рис.5 А - Зависимость числа событий N(F>F0) от амплитуды пиков для флуоресцирующих сфер различного диаметра. Сплошные линии – теоретические кривые, аппроксимирующие экспериментальные данные по уравнению (6). Значения А·В0 и Р0: 11700 кГц и 240 (диаметр 1 мкм, кривая 1), 1600 кГц и 190 (диаметр 0,5 мкм, кривая 2), 1080 кГц и 1010 (диаметр 0,17 мкм, кривая 3). Б – Зависимость числа событий от амплитуды пиков флуоресценции суспензии латексных частиц (диаметр 0,8 мкм), окрашенных ТМРЭ с различной концентрацией. Сплошные линии – теоретические кривые, аппроксимирующие экспериментальные данные по уравнению (6). Значения А·В0: 5400 кГц (кривая 1, 0,1 мкМ ТМРЭ), 1500 кГц (кривая 2, 0,03 мкМ ТМРЭ), 520 кГц (кривая 3, 0,01 мкМ ТМРЭ) Зависимость числа частиц в конфокальном объеме, определенного методом ААП, от концентрации митохондрий.

Было обнаружено, что полученные зависимости числа событий N(F>F0) от амплитуды пиков для эксперимента, представленного на рис.4А, плохо аппроксимируются уравнением (6). Это связано с высокой концентрацией белка и, как следствие, нахождением в конфокальном объеме больше одной частицы. На рис.6А, Б показаны зависимости параметров Р0 и А·В0 от концентрации белка в пробе. Линейный характер концентрационной зависимости параметра Р0 наблюдался вплоть до концентрации белка 0,мг/мл. При этом параметр яркости А·В0 (рис.6Б) оставался примерно одинаковым во всем диапазоне концентраций белка. Поэтому для дальнейших Число событий исследований были выбраны условия нахождения в конфокальном объеме не более одной частицы.

Б Рис.6 А – Зависимость параметра Р0 от концентрации энергизованных митохондрий в пробе. Условия: ТМРЭ 0,03 мкМ, ротенон 7 мкМ, сукцинат мМ. Б – Зависимость параметра А·В0 для условий эксперимента рис.6 А.

Определение мембранного потенциала на уровне единичных митохондрий.

На рис.7А показаны записи интенсивности флуоресценции суспензии выделенных митохондрий, окрашенных ТМРЭ, на рис.7Б – зависимость числа событий N(F>F0) от амлитуды пиков и соответствующие теоретические кривые.

Среднее значение параметра А·В0 (характеризующего яркость одной митохондрии), измеренное для шести препаратов выделенных митохондрий в энергизованном состоянии при концентрации ТМРЭ 0,03 мкМ, составило 5950±390 кГц. Зная яркость одной молекулы родамина, можно посчитать мембранный потенциал по уравнению Нернста:

RT = - log(Cвнутр / Снар ) (7) F Яркость молекулы родамина была определена с помощью такого же подхода – анализа амплитуд пиков флуоресценции родамин-меченых липосом – и составила 1,3 кГц. Среднее значение параметра А·В0 для препаратов митохондрий в деэнергизованном состоянии, отражающее неспецифическое связывание ТМРЭ с митохондриями, составило 1905±237 кГц. Тогда число молекул родамина, вошедших в результате энергизации в одну митохондрию, 5950 кГц -1905 кГц составило N = = 3112 молекул.

род 1,3 кГц А Б Амплитуда пиков, кГц Рис.7. А – временная зависимость интенсивности флуоресценции суспензии митохондрий, окрашенных 0,03 мкМ ТМРЭ. Б – зависимость числа частиц от амплитуды пиков. 1 – митохондрии 0,0044 мг/мл, ротенон 7 мкМ, А·В0 =кГц, Р0=400; 2 – добавка сукцината 5 мМ, А·В0 =6600 кГц, Р0=540; 3 – добавка ДНФ 100 мкМ, А·В0 =2757 кГц, Р0=Принимая внутренний объем митохондрии равным 0,17 мкм3 (такая величина измерена методом электронной микроскопии для митохондрий, выделенных из печени крыс), можно рассчитать концентрацию ТМРЭ внутри частицы:

3112 мол Cвнутр = = 30 мкМ 6 1023 мол / М 0,17 10-15 л В виду очень низкой концентрации митохондриального белка в пробе, можно считать, что концентрация красителя в растворе не изменяется при добавлении митохондрий, т.е. Снар=0,03 мкМ ТМРЭ. Тогда можно рассчитать потенциал единичной митохондрии:

RT = - log(Cвнутр / Снар ) = 59 log(30 мкМ / 0,03 мкМ ) -180 мВ F Разброс в яркости частиц приводит к разнице в значениях потенциала в несколько милливольт. Подобный расчет был использован для определения Число событий изменений потенциала под действием различных разобщителей в суспензии энергизованных митохондрий. Было показано, что при добавлении 15 мкМ ДНФ потенциал уменьшается на 14 мВ.

Определение числа митохондрий в миллиграмме белка.

Как было показано ранее, параметр Р0 уравнения (6) пропорционален концентрации флуоресцирующих частиц в суспензии. Мы использовали его, чтобы рассчитать важную характеристику суспензии выделенных митохондрий – число частиц в мг белка. Для этого в качестве калибровочной кривой была измерена зависимость Р0 от концентрации флуоресцирующих сфер диаметром 0,5 мкм (рис. 8). На основании этой зависимости, взяв Р0=540 для митохондрий из эксперимента, показанного на рис.7Б, удалось определить концентрацию флуоресцирующих частиц в суспензии митохондрий N/мл=1,3·107. Подставив концентрацию митохондриального белка 0,0044 мг/мл, получаем число митохондрий в 1 мг белка N/мг=2·109 шт/мг.

Рис.8 Зависимость параметра Р0 от концентрации флуоресцирующих сфер диаметром 0,5 мкм.

Изучение взаимодействия сафранина О с митохондриями.

Традиционным методом измерения мембранного потенциала выделенных митохондрий является регистрация уменьшения флуоресценции сафранина О в ответ на энергизацию. Как предполагается, это падение флуоресценции связано с уменьшением концентрации красителя в растворе и накоплением молекул флуорофора в митохондриях в концентрации самотушения.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»