WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

На Рис.4 видно, что из исследованных 100 фотосенсибилизаторов катионный фталоцианин 2 алюминия, AlPcN4, проявлял 60 наибольшую фотодинамическую активность в данной системе, т.е. вызывал подавление 20 активности грамицидиновых каналов при наиболее низких концентрациях (Рис.4, кривая 1).

100x10-12 1x10-9 10x10-9 100x10-9 1x10-6 10x10-6 100x10C, М NiPcS4 фотоинактивацию грамицидина не вызывал (Рис.4, Рис.4. Зависимость амплитуды фотоинактивации кривая 4). Если сравнивать грамицидина А в мембране из DPhPC от фотодинамическое действие концентрации фотосенсибилизаторов. Кривая 1 – AlPcN4, кривая 2 – ZnPcS4, кривая 3 – AlPcS4, кривая ZnPcS4 и AlPcS4, то 4 – NiPcS4. Буферный раствор содержал 100 мМ KCl, цинкфталоцианин является 10 мМ MES, 10 мМ Tris, pH 7.

более эффективным фотосенсибилизатором в данной системе, чем алюмофталоцианин (Рис.4, кривые 2 и 3).

Различия в фотодинамической активности ряда фталоцианинов могут быть обусловлены различиями в 1) квантовом выходе генерации синглетного кислорода (Ф) и 2) связывании с мембраной. Согласно результатам наших измерений (по кинетике светозависимого падения флуоресценции 9,10-диметилантрацена), Ф для A, % тетракатионного фталоцианина алюминия, растворенного в DMSO, несколько меньше Ф для ZnPcS4 в тех же условиях (Таблица 2). Эти данные не соответствуют различиям в фотодинамической активности AlPcN4 и ZnPcS4 (Рис.4).

Таблица 2. Квантовый выход генерации синглетного кислорода (Ф) различными металлофталоцианинами Ф ZnPcS4 0,AlPcN4 0,AlPcS4 0,NiPcS4 AlPcN4+KF 0,1.3 Связывание с липидной мембраной ряда металлофталоцианинов в сравнении с фотодинамическим воздействием этих сенсибилизаторов на грамицидиновые каналы.

На Рис.5 представлена зависимость -потенциала липосом из яичного фосфатидилхолина от концентрации фотосенсибилизаторов. Видно, -что добавление AlPcN4 (кривая 1) -приводит к более значительному росту абсолютной величины -0 10 20 30 40 50 электрокинетического C, мкМ потенциала, чем добавление Рис.5. Зависимость -потенциала липосом из тетрасульфированных яичного фосфатидилхолина от концентрации фталоцианинов. Кривая 1 – AlPcN4, кривая 2 – фталоцианинов цинка и ZnPcS4, кривая 3 – AlPcS4, кривая 4 – NiPcS4.

алюминия (кривые 2 и 3). Это Буферный раствор содержал 10 мМ KCl, 5 мМ MES, 5 мМ Tris, pH 7.

показывает, что AlPcNэффективнее связывается с липосомами из фосфатидилхолина, чем AlPcS4 и ZnPcS4. В случае добавления NiPcS4 электрофоретическая подвижность липосом не изменялась (кривая 4), т.е. этот краситель не сорбировался на поверхности липосом.

, мВ Таким образом, данные по электрофоретической подвижности липосом в присутствии заряженных фталоцианинов коррелируют с измерениями их фотодинамической активности, позволяя сделать вывод о том, что именно различия в связывании с липидом являются причиной различий в фотодинамическом действии.

В силу важности полученной корреляции были проведены опыты по измерению связывания фталоцианинов с мембраной другим методом, а именно методом флуоресцентной корреляционной спектроскопии (FCS). Экспериментальная установка представляет собой микрофлуориметр, регистрирующий флуоресценцию F лишь от малого объема, по порядку величины составляющего 10-15 литра. Для возбуждения флуоресценции применяли He-Ne лазер с длиной волны 633 нм. Для количественной обработки флуктуирующего сигнала F(t) производится вычисление автокорреляционной функции:

F(t)F(t + ) G( ) = (1) F(t) где F(t) – средняя интенсивность флуоресценции, а F(t)- F(t) – отклонение от среднего значения. Для случая трехмерной диффузии частиц функция G() имеет вид:

1 1 G( ) = (2), N w 1+ 1+ d z d где N – среднее число флуоресцирующих частиц в конфокальном объеме, w0, z0 – геометрические характеристики конфокального объема, d - среднее время нахождения в конфокальном объеме, которое определяется размером частиц.

На Рис.6 представлены данные по связыванию AlPcS4 (правая панель) и AlPcN(левая панель) с мембранами липосом, приготовленных из яичного фосфатидилхолина.

Приведены типичные сигналы флуоресценции фотосенсибилизаторов, которые в данной шкале имеют вид прямой линии (панели A и В, кривые 1). Ниже приведены автокорреляционные функции двух красителей, характерное время корреляции которых составляет около 100 мкс (панели Б и Г). Средний ряд графиков соответствует добавлению липосом (панели A и В, кривые 2 и 3). Видно, что в случае AlPcN4 в записи флуоресценции появляются длительные пики высокой амплитуды (Рис.6, панель А, кривая 2) и происходит сдвиг автокорреляционной функции в область более продолжительных времен (Рис.6, панель Б, кривая 2). Оба наблюдения свидетельствуют о связывании красителя с мембранами липосом.

A В 2 400 t, с t, с 0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25 Г Б 1,1,006 1,04 1,1,02 1,1,1,101 102 103 104 105 106 101 102 103 104 105, мкс, мкс Рис.6. Связывание AlPcN4 (левая часть, панели A, Б) и AlPcS4 (правая часть, панели В, Г) с фосфатидилхолиновыми липосомами, измеренное методом FCS. Записи сигнала флуоресценции (панели A, В) и автокорреляционные функции (панели Б, Г). Кривые 1 – контроли, измеренные в отсутствие липосом, в присутствии 300 нM AlPcN4 (левая часть) и 300 нM AlPcS4 (правая часть); кривые 2 – в присутствии 0,0067 мг/мл липосом; кривые – в присутствии 0,67 мг/мл липосом. Экспериментальные данные хорошо аппроксимируются теоретической кривой (2) со следующими параметрами: панель Б, кривая 1 – 0,103 мс; кривая 2 – 0,20 мс (14 %) и 11 мс (86 %); кривая 3 – 0,126 мс (18 %) и 9,2 мс (82 %); панель Г, кривая 1 – 0,066 мс; кривая 2 – 0,072 мс; кривая 3 – 0,076 мс (%) и 9,6 мс (28 %).

Интенсивность флуоресценции, kГц Интенсивность флуоресценции, kГц G( ) G( ) 1.3 Сравнение действия фторид-иона на фотоинактивацию грамицидиновых каналов, сенсибилизированную положительно и отрицательно заряженными металлофталоцианинами.

Ранее было показано, что добавление фторид-ионов приводит к подавлению фотоинактивации грамицидиновых каналов в присутствии сульфированных фталоцианинов алюминия и десорбции этих фотосенсибилизаторов с поверхности нейтральных липидных мембран (Rokitskaya et al., 2000). Этот результат трактовался как следствие возрастания отрицательного заряда красителя при присоединении аниона фторида к центральному атому алюминия в молекуле алюмофталоцианина. Такая трактовка предполагала, что добавление фторид-ионов должно вызывать возрастание сорбции AlPcN4 на поверхности липосом вследствие уменьшения общего положительного заряда молекулы при связывании аниона фторида, приводящего к повышению липофильности молекулы. Однако поставленные нами опыты не подтвердили данного предположения.

Как видно на Рис.2 (кривая 3), 1,добавление 1 мМ KF приводит к 1,0 почти полному снятию действия света на грамицидиновые каналы в 0,присутствии AlPcS4, в соответствии с 0,данными, полученными Рокицкой и 0,4 Col 1 vs Col 2 соавт. (2000). На Рис.7 представлена 0,зависимость нормированной амплитуды фотоинактивации 0,0 5 10 15 20 25 грамицидиновых каналов от KF, мМ концентрации фторид-анионов для Рис.7. Зависимость амплитуды фотоинактивации грамицидина А в мембране из DPhPC от ряда фотосенсибилизаторов: ZnPcS4, концентрации фторида калия. Кривая 1 – ZnPcS4, AlPcS4 и AlPcN4.

кривая 2 – AlPcN4, кривая 3 – AlPcS4. Буферный раствор содержал 100 мМ KCl, 10 мМ MES, Согласно полученным мМ Tris, pH 7.

данным, фторид калия подавляет фотоинактивацию грамицидиновых каналов в нейтральных мембранах в присутствии AlPcN4 (Рис.7, кривая 2), так же как и в присутствии AlPcS4 (Рис.7, кривая 3) и не действует на фотодинамическую активность ZnPcS4 (Рис.7, кривая 1).

1.4 Сравнение влияния фторид-иона на связывание с мембраной положительно и отрицательно заряженных металлофталоцианинов.

нормированная амплитуда A Б 1,1,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,101 102 103 104 101 102 103 104 105, мкс, мкс Рис.8 Действие KF на связывание AlPcN4 (A) и AlPcS4 (Б) с фосфатидилхолиновыми липосомами, измеренное методом FCS. Кривые 1 – автокорреляционные функции без липосом, в присутствии 300 нM AlPcN4 (A) и AlPcS4 (Б); кривые 2 – в присутствии 0,мг/мл липосом; кривые 3 – после добавления 1 мM KF; кривая 4 – после добавления мM KF. Экспериментальные данные хорошо аппроксимируются теоретической кривой (2) со следующими параметрами: панель A, кривая 1 – 0,1 мс; кривая 2 – 0,1 мс (22 %) и 7,мс (78 %); кривая 3 – 0,14 мс (77 %) и 10,6 мс (23 %); кривая 4 – 0,15 мс. панель Б, кривая 1 – 0,09 мс; кривая 2 – 0,07 мс (69 %) и 6,3 мс (31 %); кривая 3 – 0,08 мс.

На Рис.8 показано влияние фторид-аниона на связывание AlPcN4 и AlPcS4 с мембранами липосом из яичного фосфатидилхолина, измеренное методом FCS. В случае AlPcN4 добавление липосом приводит к появлению плеча на автокорреляционной функции (Рис.8, панель А, кривая 2). Добавление KF вызывает исчезновение этого плеча (Рис.8, панель А, кривая 4). В случае AlPcS4 добавление липосом приводит к появлению плеча на автокорреляционной функции, но это не так ярко выражено, как в случае катионного алюмофталоцианина (Рис.8, панель Б, кривая 2). Добавление фторида калия к липосомам с тетрасульфированным алюмофталоцианином вызывает исчезновение этого плеча (Рис.8, панель Б, кривая 3). При сравнении кривой 2 (панель А) в отсутствие KF и кривой 4 (панель А) в присутствии 10 мМ KF видно, что как и в случае AlPcS4 (Рис.8, панель Б, кривые 2 и 3), фторид-ион вызывает десорбцию AlPcN4 с поверхности мембран липосом.

Таким образом, данные по фотоинактивации грамицидиновых каналов коррелируют с данными, полученными методом FCS, о том, что фторид-анион вызывает десорбцию AlPcN4 с поверхности мембраны.

1.5 Действие анионов фторида и фосфата на спектры флуоресценции металлофталоцианинов.

При измерении спектров флуоресценции выявлен коротковолновый сдвиг положения максимума в спектре флуоресценции AlPcN4 в этаноле под действием фторид- G( ) G( ) ионов (Рис. 9), аналогичный сдвигу для AlPcS4, что свидетельствует об образовании комплекса фторида-иона с фталоцианином алюминия. Подобный сдвиг наблюдался в наших экспериментах и под действием фосфат-иона.

а б 1,1,1,1,0,0,0,0,0,0,0,0,0,660 680 700 720 0,660 680 700 720, нм, нм Рис. 9. Спектры флуоресценции AlPcN4 (а) и AlPcS4 (б) в этаноле в отсутствие (сплошные линии) и в присутствии 1 мМ KF (штриховые линии).

На основании полученных данных нами A - - выдвинута гипотеза о важной роли Me координационного взаимодействия центрального - _ - O атома металла фталоцианина с фосфатной группой O P O O липида в связывании металлофталоцианинов с фосфатидилхолиновой мембраной. Кроме того, мы Б предполагаем, что на эффективность + + Me координационного взаимодействия центрального + + _ O атома металла фталоцианинов с фосфатной группой O P O O липида значительное влияние оказывает электрическое поле, которое создают заряды, Рис.10. Схема взаимодействия AlPcS4 (А) и AlPcN4 (Б) с расположенные на периферии молекулы фосфатными группами липидов.

фталоцианина. Четыре отрицательных заряда в случае AlPcS4 существенно препятствуют взаимодействию красителя с фосфатной группой липида, в то время как четыре положительных заряда в случае AlPcN4 такое взаимодействие облегчают (Рис.10).

Эффект фторид-ионов хорошо объясняется в рамках предположения о том, что связывание AlPcN4 с фосфолипидной мембраной, так же как и в случае сульфированных металлофталоцианинов, определяется координационным взаимодействием центрального атома металла с фосфатной группой липида, которая может быть вытеснена из Флуоресценция, у.е.

Флуоресценция, у.е.

координационной сферы алюминия вследствие конкурентного замещения фторид-ионом (Рис.11).

O _ O P O O + N SOKF SON _ N N + SO3_ Al N N SON N + O _ O P O Al O N + _ N SO_ SO3 SOO _ SOO P O O _ + N SO3_ SO+ F Al _ SO_ O _ SOO P O O + N Рис.11. Схема комплексообразования KF с AlPcS4, которое приводит к десорбции AlPcS4 с поверхности мембраны.

2.1 Влияние заряда мембраны на связывание катионных и анионных фталоцианинов.

Для изучения влияния заряда мембраны на эффективность связывания были поставлены опыты с отрицательно заряженными липосомами (из фосфатидилсерина мозга быка) и положительно заряженными липосомами (с добавлением цетилтриметиламмония, CTAB).

A Б 1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,101 102 103 104 105 101 102 103 104 105, мкс, мкс Рис.12. Влияние CTAB на связывание AlPcN4 (панель A) и AlPcS4 (панель Б) с фосфатидилхолиновыми липосомами, измеренное методом FCS. Кривая 1 – автокорреляционная функция в отсутствие липосом, в присутствии 300 нМ AlPcN4;

кривая 2 – в присутствии 0,67 мг/мл липосом; кривая 3 – после добавления 200 мкM CTAB. Экспериментальные данные хорошо аппроксимируются теоретической кривой (2) со следующими параметрами D: панель A (AlPcN4) кривая 1 – 114 мкс; кривая 2 – 116 мкс (19 %), 6900 мкс (81 %); кривая 3 – 100 мкс (87 %), 6200 мкс (13 %); панель Б (AlPcS4) кривая 1 – 66 мкс; кривая 2 – 74 мкс (85 %), 7700 мкс (15 %); кривая 3 – 6600 мкс.

На Рис.12 представлены данные, полученные методом FCS, по влиянию положительно заряженного амфифильного вещества CTAB на связывание AlPcN4 (панель А) и AlPcS4 (панель Б) с липосомами, приготовленными из яичного фосфатидилхолина. В случае AlPcN4 добавление липосом вызывает сдвиг автокорреляционной функции в сторону больших времен (Рис.12, панель А, кривая 2). Добавление CTAB приводит к практически полному возвращению автокорреляционной функции к контролю (Рис.12, панель А, кривая 3). В случае AlPcS4, в согласии с ранее описанными данными, добавление липосом не вызывает значительных изменений автокорреляционной функции (Рис.12, панель Б, кривая 2), тогда как добавление СТАВ к липосомам из фосфатидилхолина в присутствии AlPcS4 приводит к значительным изменениям (Рис.12, панель Б, кривая 3). Автокорреляционная функция при этом сдвигается вправо, т.е.

введение положительного заряда на поверхность нейтральных липосом увеличивает связывание анионного алюмофталоцианина.

Мы также изучили влияние заряда мембраны на связывание катионных и анионных фталоцианинов другим способом, а именно: методом измерения -потенциала липосом.

На Рис.13 представлена зависимость -потенциала отрицательно заряженных липосом, приготовленных из липида E.coli, от концентрации фотосенсибилизаторов. Добавление катионного фотосенсибилизатора AlPcN4 к таким липосомам приводило к резкому изменению электрофоретической подвижности (Рис.13, кривая 1), что выражалось в G( ) G( ) изменении знака -потенциала. В случае анионных фотосенсибилизаторов электрофоретическая подвижность липосом изменялась слабо. Можно заключить, что анионные фталоцианины не сорбировались на поверхности отрицательно заряженных липосом (Рис. 13, кривые 2, 3, 4).

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»