WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

typhimurium № 9640, S. typhimurium. При определении вирулентности сальмонелл, указанные выше культуры, перешедшие в НС под воздействием повышенной температуры (56 оС), вводили внутрибрюшинно белым мышам самцам весом 16-г в объеме 1 мл. Доза заражения составила 107 КОЕ/мл. Для заражения на каждый штамм брали по 10 мышей. Контролем служила группа животных (10 мышей), которым не вводили суспензию сальмонелл. Для бактериологического исследования брали кусочки паренхиматозных органов (печени и селезенки).

Посев производили параллельно на чашки с висмут-сульфит-агаром и среды накопления (предлагаемую, магниевую и селенитовую) с последующим пересевом на чашки с висмут-сульфит-агаром. Посевы инкубировали при 37 оС в течение 24 ч. Дальнейшее определение биохимических и серологических признаков проводили по действующим нормативным документам.

Содержание аминного азота определяли формольным титрованием согласно ФС 42 – 3874 – 99 «Физико-химические, химические, физические и иммунохимические методы контроля медицинских и иммунобиологических препаратов». Величину рН измеряли с помощью иономера универсального ЭВ-со стеклянным электродом.

При изучении эффективности разработанной среды в полевых условиях исследована вода р. Дон, вода горканализации г. Ростова-на-Дону и г. Азова.

В соответствии с участками водопользования и гидрологическим режимом на Нижнем Дону для исследования были выбраны следующие биотопы:

№ 1 – в районе водозабора № 2 г. Ростова-на-Дону;

№ 2 – в районе городского пляжа г. Ростова-на-Дону;

№ 3 – в районе Речного вокзала г. Ростова-на-Дону;

№ 4 – 500 м ниже впадения р. Темерник;

№ 5 – 500 м ниже выпуска сточных вод горканализации г. Ростова-на-Дону;

№ 6 – в районе водозабора г. Азова;

№ 7 – в районе городского пляжа г. Азова;

№ 8 – 500 м ниже выпуска горканализации г. Азова.

Отбор проб сточных вод горканализации городов Ростова-на-Дону и Азова осуществляли:

№ 1 – в приемной камере;

№ 2 – после первичных отстойников;

№ 3 – после вторичных отстойников;

№ 4 – после очистки.

Отбор проб производили батометром в стерильные бутылки из поверхностного горизонта на глубине 0,5 м. При этом регистрировалась метеорологическая обстановка: температура воздуха и воды, атмосферные осадки.

Пробы отбирали во все сезоны года.

Объем работ в полевых условиях составил 165 проб воды.

При исследовании воды поверхностных водоемов производили посев 100,0 мл воды во флаконы, содержащие 100,0 мл среды, 10,0 мл – во флаконы с 10,0 мл среды, 1,0 мл и последующие разведения (от 10-1 до 10-3) в пробирки, содержащие 9 мл среды в 2-х параллельных рядах. Посевы инкубировали 24 ч при температуре 37 оС. Из каждой емкости, где отмечено равномерное помутнение среды делали петлей высев на 2 чашки с висмут-сульфит-агаром. Через 24 ч инкубации при температуре 37 оС отбирали подозрительные на сальмонеллы колонии. Окончательное определение биохимических и серологических свойств проводили по действующим нормативным документам.

При исследовании сточных вод до очистки: засевали 2 объема по 1,0 мл и по 2 объема из разведений от 10-1 до 10-7; после очистки – 2 объема по 100 мл, объема по 10,0 мл, 2 объема по 1,0 мл и по 2 объема из разведений 10-1 до 10-3.

Посевы инкубировали 24 ч при температуре 37 оС. Из каждой емкости, где отмечено равномерное помутнение среды делали петлей высев на 2 чашки с висмут-сульфит-агаром. Через 24 ч инкубации при температуре 37 оС отбирали подозрительные на сальмонеллы колонии. Окончательное определение биохимических и серологических свойств проводили по действующим нормативным документам.

Определение количества сальмонелл проводили по таблицам ХоскинсаМура (МУК 4.2.1884-04).

Статистическую обработку полученных данных осуществляли по стандартной методике вычисления (M ± m) и критерия Стьюдента. Число вариантов 3. Достоверность различий оценивали при уровне вероятности p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Поскольку цель работы – создание среды накопления, важно было подобрать питательную основу, позволяющую накапливать биомассу сальмонелл, и вещества – ингибиторы роста возможной сопутствующей микробиоты. При решении вопроса о составе среды накопления для сальмонелл приняты во внимание не только собственные, но и данные других исследователей.

При определении влияния экстракта кормовых дрожжей, едкого натра и калия фосфорнокислого однозамещенного на накопление сальмонелл установлено, что оптимальным соотношением этих ингредиентов является содержание 4,5 – 5,г/л, 1,3 – 1,4 г/л, 8,6 – 8,8 г/л, соответственно. pH составил 6,6 – 6,8. Увеличение или уменьшение концентрации ингредиентов приводило к повышению или понижению pH, что снижало эффективность накопления тест-штаммов.

В качестве ингибиторов сопутствующей микробиоты нами были выбраны бриллиантовый зеленый и кристаллический фиолетовый. Анализ полученных данных свидетельствует, что 0,01 % раствор кристаллического фиолетового не задерживает рост сальмонелл в концентрациях 8,0 мл/л, 9,5 мл/л, 10,0 мл/л, 20,мл/л. Данные концентрации также не оказывают влияния на рост E. coli и K.

pneumoniae. В тоже время рост E. faecalis полностью подавлялся при добавлении в среду 10,0 и 20,0 мл/л 0,01 % раствора кристаллического фиолетового. Добавление к питательной основе 0,1 % раствора бриллиантового зеленого в концентрации 4,мл/л не повлияло ни на рост сальмонелл, ни на рост сопутствующей микробиоты.

Увеличение вносимой концентрации до 5,0 – 10,0 мл/л не оказывало подавляющего воздействия на рост сальмонелл, но ингибировало рост E. coli, K. pneumoniae и E. faecalis. Сочетание 5,0 мл/л 0,1 % раствора бриллиантового зеленого и 10,0 мл/л 0,01 % раствора кристаллического фиолетового привело к подавлению роста E.

coli, K. pneumoniae и E. faecalis при посеве 1000, 100 и 10 КОЕ/мл, не оказывая влияния на рост тест-штаммов сальмонелл.

В результате проведенной работы сконструирована среда накопления для выделения сальмонелл из водных объектов, в которую в качестве источника питания мы ввели сухой экстракт кормовых дрожжей (5,0 г/л), соли калия (8,8 г/л) и натрия (1,4 г/л) для создания оптимальной pH, 0,1 % раствор бриллиантового зеленого (5,0 мл/л) и 0,01 % раствор кристаллического фиолетового (10 мл/л), в качестве ингибиторов роста сопутствующей микробиоты.

Сконструированная среда накопления прошла всестороннюю проверку – изучены ее физико-химические и биологические свойства. Среда накопления представляет собой прозрачную жидкость, травянисто-зеленого цвета, pH – 6,6 – 6,8, содержание аминного азота – от 0,8 до 1,0 %.

Предлагаемая среда накопления чувствительна: обеспечивает рост тестштаммов сальмонелл при посеве единичных клеток, чем выгодно отличается от аналогичных сред, применяемых в практике здравоохранения в настоящее время (табл. 1).

Таблица 1.

Сравнение чувствительности сред накопления для сальмонелл Тест-штамм Опытная среда Магниевая среда Селенитовая среда 10-6 10-7 10-8 10-6 10-7 10-8 10-6 10-7 10-S. typhi № + - - - - - - - S. paratyphi B № + + + + + + + + + S. paratyphi B № + + + + + - + + S. typhimurium № + + + + + + + + + S. typhimurium № + + + + + + + - S. typhimurium + + + + + + + + S. derby + + + + + + + + S. enteritidis + + - - - - + + S. anatum + + + + + + + + Примечание: + сплошной рост, - рост отсутствует Наименьшее время, которое требуется для накопления биомассы сальмонелл составляет 6 ч, оптимальным же является 24 ч при инкубации при температуре 37 оС.

Культуры сальмонелл, выращенные на разработанной среде, обладали типичными свойствами.

При изучении эффективности накопления сальмонелл, получены следующие данные: накопление биомассы S. paratyphi B № 506, S. typhimurium № 301, S.

typhimurium № 9640, S. typhimurium 3107 раз, S. paratyphi B № 8006 – в 7108 раза, S. anatum – в 2108 раз. Магниевая среда уступает по эффективности накопления некоторых сероваров сальмонелл. Так, накопление S. paratyphi B № 506 в 1,5 раза меньше, чем на предлагаемой, S. typhimurium № 9640 – в 3,3 раза, S. typhimurium – 4,4 раза, S. anatum – в 5,0 раз (табл. 2).

Таблица Сравнение эффективности накопления сальмонелл при использовании предлагаемой и магниевой сред накопления (посевная доза 10 КОЕ/мл) Предлагаемая Магниевая среда среда Тест-штамм Количество сальмонелл (КОЕ/л) n t p M1 ± m1 M2 ± mS. paratyphi B № 3108±5107 2108±3107 9 2,5 <0,S. paratyphi B № 6109±3108 1105±1104 9 17,9 <0,S. typhimurium № 3108±2107 1108±1107 9 4,1 <0,S. typhimurium № 3108±4107 9106±4105 9 4,3 <0,S. typhimurium 1108±3107 3108±5107 9 2,5 <0,S. anatum 2109±4108 4108±3107 9 3,6 <0,S. derby 7107±8106 1106±2105 9 8,0 <0,Увеличение биомассы на селенитовой среде было незначительным (табл. 3).

Таблица Сравнение эффективности накопления сальмонелл при использовании предлагаемой и селенитовой сред накопления (посевная доза 10 КОЕ/мл) Предлагаемая Селенитовая среда среда Тест-штамм Количество сальмонелл (КОЕ/л) n t p M1 ± m1 M2 ± mS. paratyphi B № 3108 ± 5107 3102 ± 210 9 5,1 <0,S. typhimurium № 3108 ± 2106 1102 ± 5,7 9 10,2 <0,S. typhimurium № 3108 ± 4107 рост отсутствует - - - S. typhimurium 1108 ± 5107 рост отсутствует - - - S. anatum 2109 ± 4108 рост отсутствует - - - S. derby 7107 ± 8106 рост отсутствует - - - S. paratyphi B № 6109 ± 3108 рост отсутствует - - - Разработанная нами среда накопления позволяет ингибировать рост всех тест-штаммов (E. coli № 3912/41, S. aureus № 6538- pATCC, E. coli, K. pneumoniae, E. faecalis, Sh. flexnery 2 а № 170) при посеве 100, 100 и 10 КОЕ/мл. В тех же условиях селенитовая среда не подавляла роста S. aureus № 6538- pATCC, E. faecalis, а магниевая среда не обеспечивала подавления роста E. coli № 3912/41, E. coli и K. pneumoniae. При изучении ингибирующих свойств сравниваемых сред с применением смеси тест-штаммов (E. coli № 3912/41 из разведения 10-5 и S.

paratyphi B № 506 из разведения 10-6) было зарегистрировано подавление роста кишечных палочек на предлагаемой среде при культивировании суспензии при температуре 37 оС в течение 24 ч, тогда как селенитовая и магниевая не задерживали роста данного микроорганизма (табл. 4).

Таблица 4.

Показатель ингибирования роста сопутствующей микрофлоры с применением смеси тест-штаммов Среда S. paratyphi B № 506 E. coli № 3912/(КОЕ/мл) (КОЕ/мл) Предлагаемая 31010 ± 5107 Рост отсутствует Магниевая 11010 ± 2107 3103 ± Селенитовая 3104 ± 1103 1103 ±Установлено, что хранение разработанной среды при температуре от 2 до 25 оС в течение года не оказывало влияния на чувствительность, эффективность и ингибирующие свойства предлагаемой среды.

Нами установлена возможность перехода бактерий рода Salmonella в НС под о действием повышенной температуры (56 С), и сочетания действия пониженной о температуры (6 С) и отсутствия питательных веществ. Показано влияние на переход клеток в НС дозы заражения. Если в условиях повышенной температуры и дозы заражения 102 КОЕ/мл клетки сальмонелл переходили в НФ через 3 – 4 мин прогревания (рис. 1), то при увеличении вносимой дозы до 107 КОЕ/мл время перехода составило 14 мин (рис. 2).

2,1,каталаза контроль 0,время (мин) Рис. 1. Динамика образования НФ S. typhimurium № 9640, под действием повышенной температуры (доза заражения 102 КОЕ/мл ).

lg, КОЕ/мл каталаза контроль 0 2 4 6 8 10 12 время (мин) Рис. 2. Динамика образования НФ S. typhimurium № 9640, под действием повышенной температуры (доза заражения 107 КОЕ/мл ).

При культивировании сальмонелл при пониженной температуре и состоянии «голода» тест-штаммы переходили в НФ в течение 33 – 35 суток (доза заражения 102 КОЕ/мл) (рис. 3), то при увеличении дозы до 107 КОЕ/мл происходило и увеличение срока пребывания изучаемых культур в вегетативном состоянии на 95, 105 и 108 сутки у S. paratyphi B № 8006, S. anatum, S. typhimurium № 9640, соответственно. Добавление каталазы к суспензии клеток, содержащей НФ, приводило к реверсии клеток в вегетативное состояние, после того как указанные выше клетки переставали высеваться на твердых питательных средах.

lg, КОЕ/мл 2,1,контроль каталаза 0,время (сутки) 0 2 6 10 15 20 25 30 33 Рис. 3. Динамика образования НФ S. typhimurium № 9640, под действием пониженной температуры (доза заражения 102 КОЕ/мл ).

При изучении возможности реверсии клеток, находящихся в состоянии некультивируемости, с помощью сред накопления были получены следующие результаты: разработанная нами среда позволяла не только восстанавливать данные клетки, но и накапливать биомассу. Магниевая и селенитовая среды таким действием не обладают.

Нами проведена серия экспериментов по изучению возможности сохранения НФ сальмонелл своих вирулентных свойств. Тест-штаммы (S. paratyphi B № 8006, S. typhimurium № 9640, S. typhimurium), прогретые при температуре 56 оС в течение 14 мин в количестве 107 КОЕ/мл, вводили белым мышам-самцам внутрибрюшинно по 1 мл. Через 24 ч данные тест-штаммы выделены из печени и селезенки животных, что свидетельствует о сохранении НФ сальмонелл своих биологических свойств. В контрольной группе не отмечено выделение вышеуказанных штаммов, Эффективность предлагаемой среды накопления для сальмонелл была доказана при проведении полевых испытаний. С помощью различных сред накопления было исследовано 56 проб сточной воды городов Ростова-на-Дону и Азова. При изучении воды горканализации г. Ростова-на-Дону сальмонеллы выделены в 100,0 % исследованных проб с помощью разработанной нами среды, в 84,4 % – с магниевой и лишь в 18,8 % – с селенитовой. Средний индекс сальмонелл составил 6015,6±3310,0 КОЕ/л при использовании предлагаемой среды, 202,2±63,КОЕ/л – магниевой и 3,4±1,2 КОЕ/л – селенитовой. При исследовании воды lg, КОЕ/мл горканализации г. Азова в 83,3 % проб были обнаружены сальмонеллы при использовании разработанной среды, 66,6% и 33,3 % – магниевой и селенитовой сред, соответственно. Средний индекс составил 1380,6 ± 459,5 КОЕ/л при использовании разработанной нами среды, 65,3 ± 22,0 КОЕ/л – магниевой и лишь 6,0 ± 2,1 КОЕ/л – селенитовой. Всего на разных этапах очистки сточной воды выделено 437 культур бактерий рода Salmonella 47 сероваров. Из них 280 культур при помощи разработанной среды, 127 – магниевой и лишь 30 – селенитовой. При использовании разработанной среды из воды горканализации чаще других выделены следующие серовары: S. derby, S. essen, S. typhimurium, S. brandenburg, S.

enteritidis, магниевой – S. brandenburg, S. derby, S. essen, S. heidelberg и S. derby, S.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»