WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Нами подобраны условия и реактивы для щадящей деконтаминации образцов мокроты в прямом ускоренном микробиологическом методе (табл. 3). В основу первых трех способов деконтаминации мокроты взят общепринятый 10% раствор трехзамещенного фосфорнокислого натрия, меняется только реактив для разведения осадка мокроты. В четвертом способе использовали NALC-NaOH с разведением осадка мокроты фосфатным буфером рН 6,8.

Таблица 3.

Способы деконтаминации мокроты с использованием различных реактивов.

№ № Наименование реактивов для деконтаминации 10% раствор трехзамещенного фосфорнокислого натрия (Na3PO4 ) с разведением осадка мокроты дистиллированной водой 10% раствор трехзамещенного фосфорнокислого натрия с разведением осадка мокроты фосфатным буфером рН 6,10% раствор трехзамещенного фосфорнокислого натрия с разведением осадка мокроты 1% раствором лимонной кислоты 4 NALC-NaOH с разведением осадка мокроты фосфатным буфером рН 6,Каждый способ деконтаминации мокроты изучен не менее чем, на образцах мокроты при определении ЛЧ МБТ разрабатываемым методом в сравнении с методом абсолютных концентраций, используемом в практическом здравоохранении (рис. 1, 2 и 3) Рисунок 1.

Совпадение результатов определения ЛЧ МБТ (в %), полученных прямым ускоренным микробиологическим методом при различных способах деконтаминации мокроты, в сопоставлении с методом абсолютных концентраций.

100,0 94,0 92,88,90,76,80,70,60,50,40,30,10,20,5,3,2,10,0, деконтаминация способ 1 способ 2 способ 3 способ мокроты % совпадения результатов определения ЛЧ МБТ, полученных двумя методами частота контаминации питательной среды Показано, что наибольшее совпадение результатов (94%) зафиксировано при использовании способа деконтаминации мокроты № (10% раствор Na3PO4 с разведением осадка мокроты 1% раствором лимонной кислоты). При испытании способа деконтаминации мокроты № 4, совпадение результатов определения ЛЧ МБТ, полученных двумя методами, составило 92%. Наименьшее совпадение результатов оказалось при применении способов деконтаминации мокроты № 1 и № 2 – 76% и 88% соответственно.

Частота контаминации питательной среды показывает, что способы № 1 и являются более жесткими, по сравнению со способами № 3 и 4, то есть, жизнеспособность M.tuberculosis лучше сохраняется при деконтаминации мокроты последними двумя способами.

Рисунок 2.

Совпадение результатов определения ЛЧ МБТ (в %), полученных прямым ускоренным микробиологическим методом, в зависимости от количественного содержания микобактерий в мокроте, при сопоставлении с методом абсолютных концентраций.

120,93,90,90,985,7 92,9 95,88,100,68,80,60,40,20,0,деконтаспособ 1 способ 2 способ 3 способ минация мокроты Значительное содержание МБ в мокроте* Незначительное содержание МБ в мокроте* * по результатам микроскопии На рисунок 2 показано, что при способе деконтаминации мокроты № 3, примененного в образцах мокроты с незначительным содержанием микобактерий, результаты определения ЛЧ МБТ составили 95,5% совпадений, что достоверно выше (р<0,05), чем при использовании других способов деконтаминации мокроты. В образцах мокроты со значительным содержанием микобактерий совпадение результатов определения ЛЧ МБТ двумя методами было в пределах 88,9-93,1%.

Рисунок 3.

Совпадение результатов определения ЛЧ МБТ (в %), полученных прямым ускоренным микробиологическим методом, в зависимости от продолжительности исследования, при сопоставлении с методом абсолютных концентраций.

91,94,93,95,86,83,72,66,62, деконтаминация способ 1 способ 2 способ 3 способ мокроты Продолжительность исследования: 10 дней 14 дней 21 день На рисунке 3 показано, метод абсолютных концентраций полностью подтверждает показания прямого ускоренного микробиологического метода при использовании способа деконтаминации мокроты № 3 (результаты, полученные на 10 день) и способа № 4 (результаты получены на 21 день исследования). В целом, наиболее стабильные и высокие показатели совпадения результатов определения ЛЧ МБТ, полученных двумя методами, были при использовании в разрабатываемом методе способа деконтаминации мокроты № 3 – 91,3-100%.

Статистическим методом Bayesian-анализ проведена оценка чувствительности, специфичности и эффективности прямого ускоренного микробиологического метода определения лекарственной чувствительности M.tuberculosis по каждому из противотуберкулезных препаратов в зависимости от способа деконтаминации мокроты в сравнении с методом абсолютных концентраций (табл. 4).

Таблица 4.

Основные параметры оценки прямого ускоренного микробиологического метода определения ЛЧ M.tuberculosis к изониазиду и рифампицину при различных способах деконтаминации мокроты в сравнении с методом абсолютных концентраций.

Противотубе № Способ Чувствительность, Специфичность, Эффективность ркулезный деконтамин (%) (%) препарат ации изониазид Na3PO4 + 78,8 77,4 0,дист.вода рифампицин 83,9 82,8 0,изониазид Na3PO4 + 88,6 68,8 0,2 фосфат.буф рифампицин рН=6,8 92,7 80,0 0,изониазид Na3PO4 + 97,4 92,9 0,лим.кис-та рифампицин 93,9 90,5 0,изониазид NALC+ 94,6 88,2 0,4 фосфат.буф рифампицин рН=6,8 96,9 95,0 0,Чувствительность прямого ускоренного микробиологического метода (способность выявлять истинную лекарственную устойчивость) при способе № 3 составила 97,4% для изониазида и 93,9% для рифампицина, специфичность (способность выявлять истинную лекарственную чувствительность) - 92,9% для изониазида и 90,5% для рифампицина;

эффективность (соотношение между количеством корректных результатов и общим количеством результатов) была 0,96 для изониазида и 0,93 для рифампицина. При деконтаминации мокроты способом № 4 показатели чувствительности, специфичности и эффективности нового метода выше при определении ЛЧ МБТ к рифампицину, однако показатель специфичности определения резистентности M.tuberculosis к изониазиду оказался низким - 88,2%. Кроме того, способ деконтаминации мокроты № 4 более трудоемкий и дорогостоящий по сравнению со способом деконтаминации мокроты № 3.

Таким образом, способ деконтаминации мокроты 10% раствором Na3PO4 с разведением осадка мокроты 1% раствором лимонной кислоты позволяет в новом разрабатываемом методе эффективно определять лекарственную чувствительность M.tuberculosis, в образцах мокроты, как со значительным, так и с незначительным содержанием микобактерий в сроки от 10 до 21 дня.

Прямой ускоренный микробиологический метод определения лекарственной чувствительности M.tuberculosis к изониазиду и рифампицину.

Основное преимущество прямого ускоренного микробиологического метода перед методом абсолютных концентраций заключается в продолжительности исследования лекарственной чувствительности M.tuberculosis к ПТП (табл. 5). Исследована лекарственная чувствительность микобактерий туберкулеза, выделенных от 155 больных туберкулезом легких с бактериовыделением, определенным микроскопическим методом. Больные сдавали мокроту дважды в течение двух дней. Образец мокроты, полученный от больного в первый день, исследовали обычными, принятыми в практическом здравоохранении, методами с выделением чистой культуры M.tuberculosis и определением ЛЧ МБТ к ПТП методом абсолютных концентраций, а второй образец мокроты, полученный на следующий день, исследовали новым прямым ускоренным микробиологическим методом определения ЛЧ МБТ к изониазиду и рифампицину.

Таблица 5.

Продолжительность исследования лекарственной чувствительности M.tuberculosis двумя методами.

Прямой ускоренный Метод абсолютных микробиологический метод концентраций 45-60 61-Продолжительность 10 дней 14 дней 21 день дней дней исследования ЛЧ МБТ 19 50 86 108 Обследовано больных туберкулезом [n=155] (12,2%) (32,2%) (55,5%) (69,7%) (30,3%) 11 34 60 69 Из них кол-во больных с МЛУ возбудителя [n=105] (10,5%) (32,4%) (57,1%) (65,7%) (34,3%) Из таблицы 5 видно, что продолжительность исследования лекарственной чувствительности M.tuberculosis к рифампицину и изониазиду прямым ускоренным микробиологическим методом составляет от 10 до дня, вместо 45-90 дней при методе абсолютных концентраций.

Использование нового метода позволило выявить M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью у 105 больных туберкулезом в 4-5 раз быстрее, чем методом абсолютных концентраций. У 45 (42,9%) больных туберкулезом, множественная лекарственная устойчивость возбудителя выявлена к 14 дню исследования.

Схема определения лекарственной чувствительности M.tuberculosis прямым ускоренным микробиологическим методом представлена на рис. 4.

Рисунок 4. Схема постановки прямого ускоренного микробиологического метода определения лекарственной чувствительности M.tuberculosis к рифампицину и изониазиду Микроскопия образца мокроты, полученного в 1 день.

Положительный результат Отрицательный результат микроскопии микроскопии Продолжение исследования Исследование ЛЧ M.tuberculosis к ПТП традиционными методами с выделением прямым ускоренным методом образца культуры M.tuberculosis и определением ЛЧ методом абсолютных концентраций мокроты, полученного во 2-й день Деконтаминация 10% раствором Na3PO4 с разведением осадка 1% раствором лимонной кислоты Посев осадка мокроты в 5 пробирок со средой Л-Й, три из которых не содержат ПТП (пробирки № 1, 2 и 3), четвертая пробирка содержит изониазид (1 мкг/мл), пятая – рифампицин (40 мкг/мл) Инкубация при 370С. На 10 день исследования Реакция положительная в пробирку № 1 добавляют р.Грисса (окрашивание поверхности среды в розовый или красный Реакция отрицательная цвет). Р. Грисса добавляют в (нет окраски поверхности среды) пробирки с ПТП и регистрируют результат ЛЧ Инкубация при 370С. На 14 день исследования в пробирку № 2 добавляют р.Грисса M.tuberculosis.

При окрашивании поверхности Реакция отрицательная среды с ПТП, микобактерии (нет окраски поверхности среды) туберкулеза считать устойчивыми к данному Инкубация при 370С. На 21 день исследования препарату, при отсутствии в пробирку № 3 добавляют р.Грисса окраски - чувствительными Реакция отрицательная (нет окраски поверхности среды) Результат ЛЧ МБТ к ПТП не оценивать.

Возможные причины отсутствия реакции:

- микобактерии, обнаруженные при микроскопии не жизнеспособны;

- микобактерии относятся к M.bovis Таким образом, разработан новый прямой ускоренный микробиологический метод определения лекарственной чувствительности M.tuberculosis. Чувствительность нового метода - 93,9-97,4%, специфичность - 90,5-92,9%, эффективность - 0,93-0,96 к рифампицину и изониазиду соответственно. Сокращая сроки исследования в 4-5 раз, по сравнению с методом абсолютных концентраций, новый метод способствует более раннему выявлению M.tuberculosis с МЛУ. Изоляция больных, зараженных микобактериями туберкулеза с МЛУ и своевременная коррекция химиотерапии приведет к снижению риска распространения M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью.

Изучение мутаций в генах rpoB, katG, inhA, oxyR/ahpC M.tuberculosis с помощью метода «ТБ-БИОЧИП» Известно, что устойчивость к рифампицину обусловлена мутациями в гене rpoB M.tuberculosis. Мутации в генах katG, inhA, ahpC и kasA ответственны за устойчивость M.tuberculosis к изониазиду (S. Ramaswamy, J.M. Musser 1999, О.И. Скотникова 2005, И.Г. Шемякин 2005). Выявление мутаций, обуславливающих молекулярно-генетические механизмы формирования множественной лекарственной устойчивости M.tuberculosis подтвердит правильность определения лекарственной чувствительности M.tuberculosis в прямом ускоренном микробиологическом методе. Для исследования молекулярно-генетическим методом «ТБ-БИОЧИП», подобрали 52 штамма M.tuberculosis, в которых результаты определения ЛЧ МБТ, полученные разрабатываемым методом совпадали с результатами метода абсолютных концентраций.

Выявление мутаций в генах M.tuberculosis, вызывающих устойчивость к рифампицину и изониазиду.

В гене rpoB 30 из изученных штаммов (57,7%) имели замены в кодоне 531: у 28 штаммов (53,8%) - Ser531>leu и у 2 штаммов (3,8%) - Ser531>Thr. Мутации в других кодонах определяли у единичных штаммов. В кодоне 526 обнаружены замены аминокислот у 5 штаммов (9,6%), в кодоне 511 - у 3 штаммов (5,8%), в 516 кодоне - в одном штамме M.tuberculosis.

Таким образом, выявлена доминирующая мутация в кодоне 531 гена rpoB.

Эти данные согласуются с более ранними научными работами (R.C. Cooksey 1993, Э.В. Генеpозов 1999, Е.А. Желткова 2001, М.Ю. Липин 2004) по определению ведущей роли мутаций в кодоне 531 гена rpoB в механизме формирования устойчивости M.tuberculosis к рифампицину. 13 штаммов, в гене rpoB которых не обнаружены мутации методом "ТБ-БИОЧИП", определены как чувствительные к рифампицину.

Мутации, определяющие резистентность к изониазиду, изучали в трех генах: katG, inhA и oxyR/ahpC. Мутаций в последнем гене не обнаружено.

Среди 52 штаммов M.tuberculosis у 40 штаммов (76,9%) выявлены мутации в 315 кодоне гена katG: у 19 штаммов (36,5%) замена Ser315>Thr, у штаммов (21,2%) обнаружена двойная замена Ser315>Thr и Ile335>Val, у штаммов (9,6%) - Ser315>Arg, у 4 штаммов (7,7%) - Ser315>Gly и в одном штамме - Ser315>Ile. В кодоне 328 гена katG выявлена мутация у одного штамма M.tuberculosis с заменой Thr328>Gly. Выявление мутаций в 315-ом кодоне гена katG является характерным для резистентных к изониазиду штаммов M.tuberculosis (Л.Н. Черноусова 2001, И.Г. Шемякин 2005) Особый интерес представляет группа из 11 штаммов (21,1%), в которых обнаружены двойные мутации, то есть в двух кодонах гена katG – 315 и 335, что определило их устойчивость к изониазиду. Двойные мутации редко встречаются (J.M.Musser 1996, P.Dobner 1997, H.J.Marttila 1998, М.Ю.Липин 2004), поэтому изучение и накопление данных о них в одном гене позволит использовать их в качестве эпидемиологического маркера для установления источника инфекции. Кроме мутационных изменений в гене katG, эти 11 штаммов имели мутацию в кодоне Ser531>Leu гена rpoB, что определило их устойчивость к рифампицину. Только один штамм обладал дополнительной мутацией в гене inhA (G6).

Мутации в гене inhA M.tuberculosis выявлены в двух кодонах – у штаммов (15,4%) в кодоне Т(15) и у одного штамма - в кодоне G(6). У штаммов M.tuberculosis (82,7%) мутационных изменений в гене inhA не обнаружили, что подтверждает данные мировой литературы о редкой встречаемости мутаций в этом гене - 12-30% (S. Ramaswamy, J.M. Musser 1999 г).

Генетическая характеристика штаммов M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»