WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Одновременно с этим мы оптимизировали и процедуры хроматографии на аффинной «никелевой» колонке для того, чтобы выработать оптимальный алгоритм выделения и сделать выход рекомбинантных белков максимальным при максимальной же чистоте препарата (Рис. 1). В результате этих исследований был разработан протокол, позволяющий получать миллиграммовые количества белков семейства Rpf высокой чистоты.

Стимулированная культура E.coli 5 000g, 15 мин.

Осадок клеток Супернатант осадок, ресуспендированный в буфере с 6М мочевины ультразвук, 10 раз по 15 сек., t +2C 13 000g, 25 мин.

Супернатант Осадок супернатант, разведенный буфером в 4 раза, при +4С наносили на колонку Ni2+chelation Sepharose 6B последовательные промывки 20 объемов буфера 20 объемов буфера + 50мМ имидазола 5 объемов буфера + 100мМ имидазола 2 объема буфера + 500мМ имидазола диализ 10мМ ТРИС-НСl, рН 7,4.

20часов Таблица 1. Схема выделения рекомбинантных белков семейства Rpf.

68кДа 42кДа 25кДа 14кДа 1 2 3 4 5 6 Рис. 1. SDS-электрофореграмма, характеризующая полученные рекомбинантные белки семейства Rpf. 1- маркеры молекулярной массы, 2 – Rpf t5, 3 – Rpf t4, 4 – Rpf t3, 5 – Rpf t2, 6 – Rpf t1, 7 – Rpf(M.luteus).

Динамика изменения количества Rpf в культуре M. luteus Чтобы ответить на вопрос о биохимических свойствах Rpf и о механизме его действия на бактериальную клетку и культуру в целом, необходимо было решить ряд задач, одной из которых было изучение того, сколько белка и на каких стадиях роста M. luteus продуцируется в среду.

Для оценки количества Rpf в культуральной жидкости мы использовали ряд биохимических и молекулярно-биологических методов: иммуноферментный анализ с поликлональными антителами против Rpf, иммуноблоттинг с теми же антителами и ОТПЦР (RT-PCR) для оценки наличия в клетках мРНК, специфической для Rpf.

Как видно из рис. 2, при выращивании M.luteus на богатой среде количество секретируемого Rpf достигает детектируемого уровня через 5 часов после засева инокулята. Максимум количества белка приходится на позднюю логарифмическую фазу роста культуры, в стационарной фазе количество белка быстро падает, приближаясь к нулю в районе 50 часов. В случае выращивания клеток на бедной среде ( ЛММ), количество Rpf начинает расти при переходе культуры от лаг-фазы к логарифмическому делению и так же, как и в случае богатой среды, быстро падает до практически недетектируемых значений после наступления стационарной фазы. При этом при росте на богатой среде количество Rpf в максимуме достигает не менее 1-2 мг белка на литр культуры. Однако, если оценивать количество Rpf на единицу клеток, выясняется, что на начальных стадиях роста удельный синтез Rpf максимален.

А Rpf ODотн.

OD Rpf ед.

0.0.01 0 20 40 время, ч 10 ОD OD Rpf Rpf отн.

В ед.

0.0.01 0 40 8 0 120 160 200 240 время, ч Рис. 2. Динамика накопления Rpf, определяемая при помощи ИФА в супернатантах культур M. luteus. А – богатая среда Broth E, B – среда LMM (лактатная минимальная среда).

Для подтверждения полученных данных мы использовали метод RT-PCR, позволяющий оценивать количество специфической для данного белка мРНК. Для этого выделяли тотальную РНК из выровненных количеств клеток M. Luteus, взятых на разных стадиях роста культуры, и при помощи специфических праймеров получали к-ДНК в реакции обратной траскрипции. Полученный фрагмент ДНК в дальнейшем амплифицировали в ходе полимеразной цепной реакции и конечный продукт выявляли с помощью электрофореза в агарозном геле (рис. 3).

1 2 3 4 Рис.3. Уровень экспрессии Rpf на разных стадиях роста культуры M. Luteus методом RTPCR. 1 – ОD = 0, 046 начало логарифмической фазы, 2 – ОD = 0,82 ранняя логарифмическая фаза, 3 – ОD = 4,4 поздняя логарифмическая фаза, 4 – ОD = 3,стационарная фаза, 5 – ОD = 3,6 поздняя стационарная фаза. Стрелкой указан интересующий нас фрагмент к-ДНК, рядом с каждой дорожкой присутствует контроль ( система без обратной транскриптазы).

Как видно из представленного рисунка мРНК Rpf присутствует на всех стадиях роста культуры за исключением стационарной фазы, когда синтез мРНК полностью прекращается. Причем в поздней логарифмической фазе, когда количество белка существенно в супернатанте, синтез его мРНК уже начинает снижаться. В целом, данные RT-PCR подтверждают картину, получаемую при помощи других методов.

Наряду с оценкой количества Rpf в культуральной жидкости оценивали и то, в каком виде пребывает белок в среде. Для этого супернатант культуры микрококка подвергался HPLC ( ВЖХ) гель-фильтрации на колонке Biosep 2000. В элюируемых фракциях наличие Rpf выявляли с помощью ИФА. На профиле элюции, представленном на рис.присутствуют два максимума, соответствующие Rpf. При расчете молекулярной массы можно предположить, что обнаруженные максимумы соответствуют димерной и мономерной формам белка ( 50 и 22 кДа).

51 mV 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 мин Рис.4. Профиль элюции супернатанта культуры M. luteus, выращенной на диализованной среде Broth E до OD600 = 2.7. В зоне, обозначенной подчеркиванием, при помощи ИФА, был выявлен Rpf. HPLC гель-фильтрация на препаративной колонке BioSep 2000.

В целом, этот этап работы позволил установить, что накопление Rpf в среде происходит на протяжении всего активного роста культуры, начиная с самых ранних его стадий.

Однако в стационарной фазе синтез Rpf полностью прекращается и белок исчезает из среды. В свою очередь это может означать, что белок Rpf каким-то образом связан с делением клеток и, возможно, принимает непосредственное участие в этом процессе. Так же установлено, что в среде Rpf присутствует в двух формах: мономерной и димерной.

Выявление ферментативной активности Rpf Данные, приведенные выше, свидетельствуют о том, что количество Rpf в культуральной жидкости у M.luteus достигает миллиграммов на литр, что скорее характерно для ферментов, а не для белков-регуляторов.

При предсказании третичной структуры консервативного домена Rpf на основании его аминокислотной последовательности при помощи специальных компьютерных программ, можно обнаружить некоторое структурное сходство консервативного домена Rpf с доменом активного центра лизоцима (наличие так называемого лизоцимо-подобного фолд в молекуле Rpf). Это сходство хорошо иллюстрирует компьютерная модель третичной струкруры консервативного домена Rpf, рассчитанная А. Мурзиным (частное сообщение) (рис. 5).

Рис. 5. Компьютерные модели структур куриного лизоцима (слева) и консервативного домена Rpf (предсказание) (справа). В нижней части рисунка, изображающего лизоцим хорошо видны три -спирали, являющиеся характерными для этого белка. Справа – на рисунке представлен консервативный домен Rpf, где так же видны три -спирали, взаимное расположение которых напоминает фрагмент лизоцима.

Наличие этой структуры, а так же присутствие в структуре белка в вариабельном домене так называемого Lys-M фрагмента, служащего для тесного взаимодействия белков с компонентами клеточной стенки, привело нас к предположению о том, что Rpf может быть ферментом, связанным с гидролитической модификацией клеточной стенки, сходно с лизоцимом, являющимся мурамидазой.

Для проверки этого предположения были проведены эксперименты с целью выясненеия возможного воздействия Rpf на препарат лиофилизированных клеток микрококка. Для этого была измеряна во времени оптическая плотность препарата клеток микрококка после добавления к ним Rpf. Результаты этого эксперимента представлены на рис. 6.

Динамика изменения оптической плотности препарата лиофилизированных клеток M.luteus при инкубации с Rpf контроль эл.DEAE эл.pET мут.ES мут.2Cys Rpf рек.0 5 10 15 20 25 30 35 40 время, ч Рис. 6. Изменение оптической плотности препарата лиофилизированных клеток M. luteus в трис-буфере pH8 под дейстием препарата рекомбинантного Rpf, а так же рекомбинантных Rpf белков, подвергнутых сайт-направленному мутагенезу. Эл.DEAE элюат,содержит нативный Rpf, выделенный на колонкеDEAE). Эл.pET – контрольное выделение рекомбинантного Rpf из штамма E. coli, содержащего пустой вектор без гена Rpf. Мут.ES – рекомбинантный Rpf с заменой глутамина в ES- фрагменте на глутаминовую к-ту. Мут.Cys – Rpf с заменой обоих цистеинов в консервативном домене.

Концентрации рекомбинантного Rpf – 15 мкг/мл. Препараты Rpf с замененными аминокислотами были любезно предоставлены Г.Мукамоловой.

Из рис. 6 видно, что при добавлении рекомбинантного Rpf к препарату клеток микрококка происходит падение оптической плотности, в конечном итоге приводящее к уменьшению оптической плотности примерно до 60% от начальной. Мы предполагаем, что данный эффект является отражением гидролитической активности, присущей Rpf. Столь медленное падение оптической плотности, скорее всего, связано со специфичностью Rpf.

OD600, % от контроля Вероятно, он гидролизует какие-то связи, расщепление которых не приводит к глобальным изменениям в структуре крупных частиц клеточной стенки, ведущим к их полному распаду, что могло бы привести к существенному и быстрому падению оптической плотности, как это происходит под действием лизоцима.

Существует несколько типов ферментов, для которых характерна подобная литическая активность по отношению к бактериальным стенкам: лизоцимы (мурамидазы), эндопептидазы, амидазы, карбоксипептидазы и литические трансгликозилазы. На приведенном рисунке представлена схема пептидогликана клеточной стенки E. coli и ферменты, гидролизующие различные связи этого полимера (рис. 7).

Рис.7. Ферменты клеточной стенки у E. coli и их действие на муреин (по Holtje, 1995).

GlcNAc – N-ацетилглюкозамин, MurNAc – N-ацетилмурамовая кислота, MurNAc-anh - (16)ангидромурамовая кислота. Связи, гидролизуемые соответствующим ферментом: – N-ацетилглюкозаминидазы, 2 – литические трансгликозилазы, 3 – N-ацетилмурамил-Lаланин амидаза, 3 - N-ацетилдегидромурамил-L-аланин амидаза, 4 – DD эндопептидаза, – LD карбоксипептидаза, 6 – DD карбоксипептидаза.

На основании полученных данных однозначно определить, к какому типу ферментов относится Rpf довольно сложно. Представляется, что Rpf вряд ли можно отнести к лизоцимам, несмотря на его третичную структуру, так как M. luteus - микроорганизм чрезвычайно чувствительный к действию лизоцима и малейшее его добавление в среду приводит к полному лизису клеток. Не существует также каких-либо указаний на то, что Rpf является амидазой, так как анализ его последовательности не выявляет сходства с этим типом ферментов.

В то же время, лизоцимоподобный фолд характерен для родственного лизоциму семейства белков: литических трансгликозилаз (рис.8), ферментов, моделирующих за счет гидролиза клеточную стенку микроорганизмов. Эти белки являются бактериальными мурамидазами, задействованными в метаболизме бактериальной клеточной стенки во время роста и деления, а также в процессах связанных с вирулентностью. Под действием литических трансгликозилаз бактериальная клеточная стенка не разрушается полностью (как в случае с лизоцимом), а становится более рыхлой и проницаемой. Вследствие этого кинетика разрушения препаратов стенок под действием литических трансгликозилаз замедленна, что действительно наблюдается в эксперименте, представленном на рис.6.

Рис.8. Третичная структура литической трансгликозилазы Slt 70 из E. coli. Стрелкой указан лизоцимоподобный фолд. Лизоцимоподобный фолд Rpf приведен для сравнения слева.

В пользу того, что Rpf является литической трансгликозилазой, указывает наличие в его последовательности так называемого ES-фрагмента, который высоко консервативен и у белков семейства Rpf других микроорганизмов, и который характерен для активного центра литических трансгликозилаз из семейства 1 (рис. 8А). Также для некоторых литических трансгликозилаз характерно наличие LysM домена, присутствующего и в структуре Rpf.

Литическая Последовательность трансгликозилаза LysG --ES-------------GLMQV Slt RQES-F-P-A-S--GAGLMQ MltC -TES-FNPYA-S---AGLMQV EmtA ATESGGNPNAVS-----GLMQ MltD IVESAF-P-A-S---A-GLWQ YfhD YQESHWNP-A-SPTGVRGLMM Рис.8А. Последовательности некоторых литических трансгликозилаз и белков семейства Rpf с указанием гомологичного ES-фрагмента (Blackburn & Clarke, 2000) Действительно, препараты Rpf, в которых были проведены замены в ES-фрагменте и по двум цистеинам, практически не оказывают литического действия на препараты клеток (Рис. 6).

При выращивании на бедных средах, таких как лактатная, бактерии микрококка склонны образовывать крупные агрегаты, что, скорее всего, является ответом на недостаток питательных веществ. Нами было отмечено, что при добавлении Rpf к культуре, пребывающей в подобном сильно агрегированном состоянии, происходила частичная дезагрегация клеток, и размеры агрегатов в целом уменьшались, что также может быть интерпретировано в пользу модификации клеточной стенки микрококка под действием Rpf.

В целом, можно предположить, что Rpf является пептидогликангидролазой, моделирующей состояние внешней стороны клеточной стенки M. luteus. По данным С.

Фостера среди белков, участвующих в модификации клеточной стенки спорулирующих бактерий, обязательной для прорастания спор, присутствуют и литические трансгликозилазы, очевидное сходство с которыми наблюдается у Rpf. Возможно, именно эта ферментативная активность обуславливает способность Rpf реактивировать покоящиеся клетки микрококка например способствуя локальному увеличению проницаемости клеточной стенки и приводящему к активации клеточного метаболизма и деления. С другой стороны роль Rpf в оживлении покоящихся клеток может состоять в диспергировании агрегатов клеток при их реактивации.

Иммунологические свойства белков семейства Rpf Одной из важных задач настоящего исследования было изучение иммунологических свойств белков семейства Rpf, в том числе аналогов Rpf из M. Tuberculosis. Эти исследования были проведены совместно с ЦНИИ Туберкулеза РАМН. В ходе работы были изучены параметры как гуморального, так и Т-клеточного иммунного ответа при иммунизации животных белками семейства Rpf. Была исследована продукция специфических антител и пролиферативный ответ клеток лимфоузлов на присутствие Rpf-белки в тесте in vitro (поскольку основную роль в протективном иммунном ответе на M. tuberculosis играют Т-лимфоциты).

В сыворотках с помощью иммуноферментного теста были исследованы уровни специфических антител класса IgG к белкам семейства Rpf (Рис.9). Эти исследования показали высокую иммуногенность всех белков за исключением Rpf t3. Также была обнаружена высокая степень перекрестной реактивности между белками семейства, что, очевидно, обусловлено частичной гомологичностью их структур.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»