WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

Казарьян Константин Александрович Биохимические и иммунологические свойства белков семейства Rpf – факторов роста Micrococcus luteus и Mycobacterium tuberculosis 03.00.04 – Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2004 2

Работа выполнена в лаборатории биохимии стрессов микроорганизмов Института Биохимии им. А.Н. Баха РАН.

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Капрельянц А.С.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Воробьева Л.И.

кандидат биологических наук Жердев А.В.

Ведущая организация – Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, Пущино.

Защита состоится « 25 » мая 2004 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте Биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский пр-т. д. 33 к.2.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский пр-т. д. 33 к.2..

Автореферат разослан « » _ 2004г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Орловский А.Ф.

3

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы Хорошо известно, что адаптация бактерий к неблагоприятным условиям, в ряде случаев приводит к образованию специализированных покоящихся форм, таких как споры или цисты. Однако, как стало ясно в последнее время, некоторые неспорулирующие бактерии так же могут образовывать подобные покоящиеся (дормантные) формы. Это состояние характеризуется резким снижением метаболической активности и полным отсутствием деления. Такие покоящиеся клетки, как правило, характеризуются измененной формой, утолщенной клеточной стенкой и некультивируемостью на твердых и (или) жидких питательных средах. Такие формы требуют специальной процедуры – оживления для восстановления способности к делению.

Дормантные формы микроорганизмов часто являются причиной реактивации инфекционных заболеваний, таких как туберкулез и некоторые другие тяжелые инфекции.

Полагают, что из-за малой метаболической активности покоящаяся форма клеток Mycobacterium tuberculosis устойчива к антибиотикам и может являться резервуаром для хронической туберкулезной инфекции в организме.

Механизмы, позволяющие бактериям переходить в дормантное состояние и выходить из него, пока недостаточно хорошо изучены. При исследовании условий оживления покоящейся культуры Micrococcus luteus было установлено, что компоненты культуральной жидкости активно растущей культуры этого микроорганизма способны стимулировать пробуждение покоящихся клеток. Фракционирование и дальнейшая очистка культуральной жидкости выявили, что "оживляющей" покоящиеся клетки активностью обладает секретируемый M. luteus в среду белок, названный Rpf (от английского resuscitation promoting factor). Гены, гомологичные rpf, обнаружены во многих грам-положительных микроорганизмах, объединяемых в группу Г-Ц богатых бактерий. Согласно базам данных гомологичные гены представлены в таких бактериях, как Mycobacterium tuberculosis (пять генов) и Mycobacterium leprae (два гена), а также в некоторых других микроорганизмах, а именно Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium bovis (БЦЖ), Corynobacterium glutamicum, нескольких видах Streptomyces, и прочих.

Предполагается, что все белки семейства Rpf в своем составе имеют домен с высокой степенью гомологии, а также вариабельный домен (Рис 1) Можно предположить, что белки, кодируемые генами гомологичными rpf у других микроорганизмов, могут иметь схожую с Rpf биологическую активность и обладать пробуждающими свойствами. В связи с этим большую практическую важность приобретает изучение гомологов Rpf из M. tuberculosis, поскольку латентные микобактерии обнаруживаются у 30 % населения Земли и именно они являются причиной реактивационного туберкулеза. Белки семейства Rpf из M. tuberculosis (Rv2450c – Rpf t1, Rv2389c – Rpf t2, Rv1884c – Rpf t3, Rv0867 – Rpf t4, Rv1009 – Rpf t5) могут оказаться перспективными кандидатами для включения в состав комплексной субъединичной вакцины, которая наряду с обычным туберкулезом могла бы быть протективной в случае реактивации этой тяжелой инфекции.

MW 36,(Rv0867c)t14,(Rv2450c)t(Rv2389c)t2 10,11,(Rv1884c)t (Rv1009)t 35,0 100 200 300 400 500 остаток Сигнальная последовательность Signal Консервативный Rpf-домен Rpf domain Сегмент с высоким содержением Papa пролина Рис.1. Схема строения белков семейства Rpf из Mycobacterium tuberculosis На момент начала данной работы сведения о том, к какому классу белков ( сигнальных, структурных или ферментов) относятся белки Rpf отсутствовали, также как и какие-либо сведения об их структуре. Поэтому чрезвычайно важным представляется изучение белков семейства Rpf, их структуры и свойств: биохимических и иммунологических, так как это поможет разобраться в механизмах образования покоящихся форм, что представляет интерес как для фундаментальной микробиологии, так и для прикладной науки, в связи с изучением механизмов ряда инфекционных заболеваний.

Цель и задачи исследования Основной целью настоящего исследования было выявление механизмов, которые лежат в основе действия Rpf на бактериальную клетку. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1) Разработка процедуры выделения и оптимизация условий экспрессии рекомбинантных белков семейства Rpf.

2) Изучение физико-химических свойств молекулы Rpf.

3) Анализ экспрессии Rpf на разных стадиях роста культуры M. luteus.

4) Исследование предполагаемого механизма действия Rpf на бактериальную клетку.

5) Изучение иммуномодулирующих свойств белков семейства Rpf в качестве компонентов субъединичных вакцин против туберкулеза.

Научная новизна Разработан метод получения рекомбинантных белков семейства Rpf и впервые получены рекомбинантные белки семейства Rpf из M. tuberculosis высокой чистоты.

Впервые изучена динамика накопления Rpf в культуральной жидкости M. luteus.

Выявлено наличие у Rpf гидролитической активности в отношении компонентов клеточной стенки микрококка, что позволяет отнести белки семейства Rpf к муреингидролазам. Впервые получены данные, свидетельствующие о протективных свойствах белков семейства Rpf против туберкулеза в моделях на мышах.

Практическая значимость Разработаны методики выделения рекомбинантных белков семейства Rpf. Получены данные, позволяющие рассматривать белки семейства Rpf в качестве потенциальных кандидатов на включение в состав субъединичных вакцин против туберкулеза.

Апробация работы Результаты исследований были доложены на: конференции «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии» (Дубна, 2000), конференции «First international conference bacterial and viral virulence factors» (Смоленица, 2000), 1 международном конгрессе «Biotechnology – state of art & prospects of development» (Москва, 2002), конгрессе «11 international congress of immunology» (Стокгольм, 2001), конференции «TB vaccines for the world» (Монреаль, 2003).

Публикации По материалам диссертации опубликовано 7 работ в отечественных и зарубежных изданиях.

Структура диссертации Диссертация состоит из разделов: Введение, Обзор литературы, Объекты и методы исследования, Результаты и обсуждение, Выводы. Работа изложена на страницах машинописного текста, включает 26 рисунков и 3 таблицы, список литературы включает в себя 121 наименование.

Mатериалы и методы Микрооорганизмы и среды выращивания В работе использовали Micrococcus luteus NCIMB 13267, Escherichia coli HMS174(DE3), Mycobacterium tuberculosis H37Rv. Компетентные клетки E.coli готовили по стандартной методике (Janssen & Irvin, 2001, Molecular cloning). Для выделения плазмидной ДНК использовали набор Promega Wizard Plus SV Minipreps (Promega). Для выделения РНК M.

luteus использовался набор фирмы Qiagen RNeasy Mini Kit (Qiagen). Для выращивания E.сoli и M.luteus использовали богатую среду LabM, BrothE. M.luteus выращивали также на бедной, минимальной среде, содержащей лактат и аммоний (ЛММ). Культуру M.tuberculosis выращивали на жидкой среде Мидельбрука. Все культуры выращивали при 37 С ( кроме M.luteus – при 30 С) в условиях аэрации.

ОТ-ПЦР(RT-PCR) Для полимеразной цепной реакции, сопряженной с обратной транскрипцией использовали набор AMV Reverse Transcriptase (Promega).

Праймеры для обратной транскрипции и амплификации кДНК:

(R) 5’-TTCATGTCCCAGGTGCCGTT-3’ (F) 5’-GAGGACTCGCCATGGACACC-3’ Выделение рекомбинантного белка Rpf-HisTag Micrococcus luteus (и его аналогов из M.tuberculosis) из штамма E.coli HMS174(DE3), содержащего плазмиду HisTag/pET19b Трансформированные клетки выращивали в среде Broth E в присутствии ампицеллина (100 мкг в мл) до OD600 = 0,7-0,9. Затем к культуре добавляли изопропил -Dтиогалактопиранозид до конечной концентрации 0,5 мМ и инкубировали культуру 3 часа при 37 С. Клетки разрушали ультразвуком на ледяной бане 10 раз по 15 секунд.

Хроматография на Ni2+chelation Sepharose 6B column Все этапы проводили при +4 градусах. Полученный лизат клеток центрифугировали на холоду при 13000g 25 минут, супернатант разводили в 4 раза буфером для нанесения (mM имидазола, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 6 M мочевины) и наносили на аффинную колонку Iminodiacetic acid immobilized on Sepharose (Sigma) с предварительно обработанной NiSO4. После нанесения супернатанта колонку промывали 20 объемами буфера, с 50 мМ имидазолом. Затем колонку промывали 5 объемами буфера, содержащего 100 мМ имидазола и элюировали 3-мя объемами буфера, содержащего 500 мМ имидазола.

Хроматография белков на DEAE-Sepharose Использовали DEAE-Sepharose Fast Flow (Sigma), DFF-100. Последовательно промывали колонку водой, затем 10 мМ трис-HCl pH 7.4. После нанесения образца промывали колонку 10 мМ трис-HCl pH 7.4 + 100 мМ NaCl. Элюировали 3мл 10 мМ трисHCl pH 7.4 + 330 мМ NaCl.

SDS-электрофорез белков в полиакриламидном геле (по Лэммли) Электрофорез проводили в приборе BioRad, размер пластин 8х10 см, 12% акриламида в геле. Электрофорез проводили на холоду при 30 mA на 1 пластину. 5х электродный буфер: 0,25 М трис, 2 M глицин, 0,5 M SDS pH 8,8. 8х буфер для разделяющего геля :3 М трис-HCl pH 8,8. 4х буфер для концентрирующего геля: 0,5 М трис-HCl pH 6,8.

Градиентный неденатурирующий электрофорез белков в полиакриламидном геле.

Электрофорез проводили по стандартной методике (J.M.Walker, Methods in Molecular Biology, v.32, 1994).

Иммуноблоттинг рекомбинантных белков.

Иммуноблоттинг рекомбинантных белков осуществляли по стандартной схеме ( Каталог “Sigma 1999”, стр.1490-1491):

Первичные антитела ( АТ) (поликлональные кроличьи АТ против Rpf:0,5 мкл препарата АТ в TBS: 20 мМ трис-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl). Вторичные АТ (AntiRabbit AT conjugate with Alcalic Phosphatase (Sigma)) использовали в разведении 1:5000. Мембрану промывали TBS+Tween 80 (0,05%) при 37оС, окрашивали SIGMA FAST BCIP/NBT Alcaline Phosphatase Substrate (Sigma) при комнатной температуре.

Пролиферативный тест.

Для постановки пролиферативного теста мышей иммунизировали белками семейства Rpf подкожно в подушечку задней лапы 10 мкг соответствующего белка в неполном адъюванте Фрейнда (НАФ), разведенном в 2 раза физиологическим раствором, и через недели исследовали пролиферацию клеток подколенных лимфоузлов in vitro в присутствии белков семейства Rpf. Суспензию клеток лимфоузлов (2х105 клеток/лунку) культивировали в 96-луночном планшете (фирма Costar, США) в присутствии 10 мкг/мл Rpf-белков при 370.С в атмосфере, содержащей 5% СО2 в течение 72 ч. Уровень пролиферативной активности лимфоцитов оценивали по включению Н-тимидина. Для этого за 18 ч до окончания инкубации в лунки добавляли по 0,5 µCi Н-тимидина. По окончании инкубации клетки переносили на фильтры и определяли уровень включения радиоактивной метки в ДНК с помощью сцинтиляционного счетчика.

Иммунизация.

В качестве подопытных животных были использованы мыши обоего пола линии C57BL/6JCit (В6) из питомника ЦНИИ Туберкулеза РАМН, массой 22-24 г.

Мышей иммунизировали 10 мкг белка в НАФ под кожу спины 3-кратно с 2-недельным интервалом. Через 10 суток после последней инъекции у подопытных животных из ретроорбитального синуса брали кровь для определения в сыворотке титра специфических антител класса IgG с помощью иммуноферментного теста (ELISA).

Определение количества антител и белков методом ИФА.

Количество антител к белкам Rpf в сывовротках животных определяли в соответствии с рекомендациями фирмы Pharmingen (США) с использованием меченных пероксидазой анти-IgG антител. Результаты представлены в виде показателей оптической плотности при разведении сывороток 1:500. Количество Rpf в супернатантах M.luteus определяли методом прямого ИФА по стандартной схеме по рекомендациям фирмы “Sigma, в качестве вторичных антител использовали AntiRabbit AT conjugate with Alcalic Phosphatase (Sigma) использовали в разведении 1:5000.

Заражение мышей.

Через 6 недель после последней иммунизации мышей внутривенно заражали M.

tuberculosis H37Rv в летальной дозе 2х107 КОЕ.

Протективный эффект Rpf белков оценивали по высеваемости микобактерий (число КОЕ на среде Мидельбрука) из легких и селезенки зараженных мышей, а также по длительности выживания иммунизированных и контрольных мышей.

Результаты и обсуждение Выделение рекомбинантных белков Совместно с британскими коллегами из лаборатории М. Янга (Абериствизский университет, Великобритания) в нашей лаборатории были получены генно-инженерные конструкции, позволяющие экспрессировать, все пять микобактериальных гомологов Rpf в кишечной палочке. Однако для того чтобы получить большие количества рекомбинантных белков высокой чистоты, необходимо было провести оптимизацию методов стимуляции экспрессирующих клонов и выделения рекомбинантных белков семейства Rpf. В качестве основы для выделения рекомбинантных белков, мы использовали рекомендации фирмы Novagen, разработавшей векторы серии pET и сответствующую систему экспрессии, и вносили изменения по ходу работы.

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»