WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 |

Для использования в последующих экспериментах фенольно-сульфатную суспензию подвергали центрифугированию для осаждения фракции, обогащенной иммуноглобулином. С целью предотвращения расслоения раствора при применении в качестве осадителя ПЭГ, необходимо снизить концентрацию SO42-. Для удаления примесей SO42- были использованы различные способы: диализ, ультрафильтрация, гель-хроматография, перевод сульфат-иона в малорастворимый осадок. На основании полученных результатов в дальнейшем использовали удаление примесей SO42- за счет формирования малорастворимого CaSO4 в процессе экстракции осадков раствором хлорида кальция. Данный способ наиболее быстрый по времени, в тоже время позволяющий сохранить активность антител и обеспечивающий высокий процент выхода белка. При экстракции осадка в 1-2 %-ом растворе хлорида кальция центрифугированием удаляют малорастворимый сульфат кальция, а IgG-обогащенную фракцию получают переосаждением с помощью 18% ПЭГ 4000 при рН 8,0. Далее исследовались осадки для изготовления препаратов IgG, полученные предложенным выше способом из сырья различной видовой принадлежности. В результате процент выхода и процент чистоты IgG норки и человека в полуфабрикатах для получения препаратов иммуноглобулина составили следующие значения, соответственно: куньи – 9294% и 49-51%, человек – 93% и 51%. Полученные результаты демонстрируют, что проведенные стадии фракционирования позволяют получать полуфабрикаты целевого белка с высоким процентом выхода независимо от видовой принадлежности сырья. Значение процента чистоты сопоставимо с показателями фракционирования нехроматографическими способами очистки.

На предложенный способ хранения и получения IgG-обогащенной фракции для изготовления биопрепаратов крови выдан патент на изобретение (№«Способ хранения плазмы или сыворотки крови для получения иммуноглобулиновых и альбуминовых биопрепаратов»). Растворы конечных осадков обладают заданными характеристиками для дальнейшего их фракционирования и получения иммуноглобулиновых биопрепаратов либо с помощью хроматографических подходов, либо с помощью нехроматографических технологий на основе этанола, риванола или каприловой кислоты.

Таким образом, предложенный способ обеспечивает длительное хранение сырьевой заготовки при плюсовых значениях температуры в условиях способствующих инактивации бактериальных и вирусных агентов, обеспечивающих сохранение биологических свойств белков, что позволяет проводить формирование обогащенной фракции IgG для проведения дальнейших стадий фракционирования с целью изготовления биопрепаратов крови.

Биохимические параметры IgG фракции, полученной с помощью риванола Были проведены исследования на предмет перспективности использования риванола для получения иммуноглобулинового препарата норки. С этой точки зрения изучали возможность очистки IgG путем его экстракции раствором риванола из осадка -глобулинов, полученных фракционированием плазмы под действием ПЭГ (изложенным выше способом). Суспендирование осадков осуществляли в пределах значений рН от 4,0 до 10,0 при концентрации риванола от 0,4 до 2,0%. Концентрацию IgG определяли прямым конкурентным методом ИФА для расчета процента чистоты и процента выхода целевого белка.

Установлено, что при рН 4,0 и концентрациях риванола 0,6-2,0% глобулиновый осадок практически полностью (96%) растворялся. С увеличением рН растворимость белков существенно снижалась, а при рН 9,010,0 в надосадочный раствор риванола переходит до 37% от общего белка.

При концентрации риванола 0,6% и рН экстрагирующей среды 5-отмечались (зарегистрированы) наименьшие концентрации общего белка в надосадочных фракциях. С увеличением концентрации риванола до 0,8-1,5% при рН 6,0-8,0 в надосадочном растворе концентрации общего белка увеличились в среднем в 1,5-1,9 раза. Наименьший уровень экстракции наблюдался при рН 10,0 в надосадочной фракции содержалось 4-18% от общего белка.

В образцах надосадочных фракций прямым конкурентным методом определяли концентрацию IgG для оценки биохимических параметров фракции. В качестве контроля использовали эквивалентное количество сырого осадка, экстрагированного в 5 объемах (вес/объем) 0,85% раствора натрия хлорида. Установлено (табл. 3 и 4), что при рН 4,0 и в присутствии риванола 0,6-2,0% процент чистоты целевого белка колеблется в пределах 43-51% и не отличается от величины такового показателя в контроле. В таких условиях зарегистрирован наивысший показатель экстрагируемости IgG (96%), который из-за погрешности используемого метода может на 4% превышать максимально возможное его содержание в исходном осадке. Аналогичная закономерность – отсутствие влияния риванола на процент выхода и процент чистоты IgG – наблюдалось при рН инкубационной среды 5,0. Экстракция IgG при рН 6,0 приводила к увеличению процента чистоты (60-85%) целевого белка и снижала его выход до 60-83%. Наиболее существенный фактор очистки достигался при рН 7,0-10,0. В частности, наименьшая величина процента чистоты при нейтральных и щелочных значениях рН была не ниже 72%.

Наиболее очищенные образцы IgG (90-101%) формировались в условиях рН 9,0-10,0. Однако выход целевого белка при этом существенно снижался. Так при концентрации риванола 0,6% и рН в пределах значений 6,0-10,0 выход IgG по убывающей составил 64-30%. При тех же значениях рН и в присутствии 0,8% риванола обсуждаемый показатель снижался от 85% до 35%. В условиях нейтрально-щелочной экстракции (рН 7,0-9,0), при концентрации риванола 1,02,0% до 50% IgG присутствовало в надосадочной фракции. Наименьший выход IgG в его максимально очищенной форме характерен для рН 10,0.

Надосадочные фракции и осадки, полученные под действием риванола, анализировали в градиентном (3-25%) ПАГ электрофорезе. Установлено, что максимально очищенные образцы (степень чистоты IgG 100 и более процентов), полученные при рН 9,0 или 10,0, имели в своем составе примеси трансферрина и гемоглобина, а при высоких концентрациях риванола (1,52,0%) зарегистрировано усиление полосы гемоглобина и появление на электрофореграммах высокомолекулярных примесных белков или олигомеров IgG. В риванольных надосадках присутствовали также другие индивидуально различные 3-4 белка в качестве следовых количеств примесей. При рН от 4,0 до 6,0 белковые спектры IgG обогащенных фракций принципиально не отличались от бросовых осадков. В риванольных растворах IgG только при рН 7,0 альбумин присутствовал в следовых количествах и далее при рН 8,0-10,0 в IgG обогащенных фракциях альбумин зарегистрировать не удалось.

Аналогичный электрофоретический анализ проводили с образцами бросовых осадков, сформированных в процессе риванольного фракционирования.

Установлено, что при всех использованных концентрациях риванола и рН 8,010,0 альбумин практически полностью переходил в осадок, а трансферрин более или менее равномерно распределялся между целевой надосадочной фракцией и осадком. Необходимо также отметить особенности белкового спектра осадков, формирующихся при кислых значениях рН. Известно, что при рН 4,0-4,5 риванол не взаимодействует с белками, т.е. не обладает агрегирующе-осаждающим действием. Тем не менее, по нашим данным около 4% от общего белка в обсуждаемых условиях переходило в осадок, в котором содержался преимущественно IgG и в меньшей степени альбумин.

Таблица Процент чистоты IgG норки в надосадке в зависимости от значения рН раствора и концентрации риванола, полученных экстракцией -глобулинового осадка рН Концентрация риванола,% 0,6 0,8 1,0 1,2 1,5 2,43,21,2 45,41,4 40,61,2 42,81,1 51,61,5 50,50,54,30,9 42,21,5 46,11,3 51,61,9 53,31,4 55,91,74,80,8 68,41,6 68,21,6 72,51,5 80,31,7 85,11,85,31,4 86,11,3 93,41,7 89,11,4 84,71,8 72,61, 94,31,3 95,11,6 93,51,3 96,61,5 90,31,8 89,81,92,61,6 95,81,3 99,31,2 96,11,7 104,11,5 100,81,90,61,4 96,51,5 94,21,6 100,21,7 98,71,3 90,71,Примечание: Х-ср. арифметическая, м-ошибка средней, n=Таблица 4.

Процент выхода IgG норки в в надосадке в зависимости от значения рН раствора и концентрации риванола, полученных экстракцией -глобулинового осадка рН Концентрация риванола,% 0,6 0,8 1,0 1,2 1,5 2,98,11,3 104,31,9 101,51,6 96,61,5 102,11,4 101,31,96,51,4 101,81,6 98,21,7 99,31,7 95,81,5 95,31,64,80,8 85,31,6 72,11,5 74,91,8 66,31,5 60,21,55,61,3 79,71,4 70,31,1 48,91,4 50,11,6 55,31,48,21,1 82,31,4 64,91,5 56,11,5 50,81,7 61,91,33,31,3 51,21,2 49,61,7 54,81,5 47,41,4 50,51,30,50,9 35,40,9 41,21,2 30,81,4 16,80,7 25,21,Примечание: Контроль1007%, Х-ср. арифметическая, м-ошибка средней, n=Таким образом оптимальными условиями экстракции IgG из обогащенных ПЭГ-овских осадков являются: значение концентрации риванола от 0,6 до 0,8 % и интервал рН от 7,0 до 8,0.

Биохимические параметры IgG фракции, полученной с помощью каприловой кислоты Каприловая кислота используется в производстве препаратов плазмы как осаждающий и как вирус-инактивирующий реагент. В то же время ее соли при нейтральных рН используются как стабилизаторы белка (в частности альбумина) (Steinbuch, 1980; Русанов и др., 1983). Исследовали влияние концентрации каприловой кислоты и рН в процессе экстрагирования IgG из состава -глобулиновой фракции, полученной с помощью ПЭГ (способ изложен выше). Установлено, что при рН 3,0 или 4,0 до 47% общего белка находилось в форме осадка. Наибольший осаждающий эффект зарегистрирован при рН 4,0 и концентрации каприловой кислоты 1,0%. Концентрации каприловой кислоты 0,3% и 0,5%, а также рН инкубационно-экстрагирующей среды 3,0 и 4,0 приводили к осаждению 23-40% от общего белка. При рН 5,0 и 6,0 в присутствии концентраций каприловой кислоты от 0,3% до 1% в осадке оставалось не более 13% от общего количества белка (табл. 6).

Таблица 6.

Процент выхода общего белка в надосадке в зависимости от условий экстракции осадка с помощью каприловой кислоты рН Концентрация каприловой кислоты инкубационной (в %) среды 0,3 0,5 1,3 77,51,2 60,61,1 75,21,4 70,41,1 74,51,1 53,10,5 88,21,3 98,11,1 70,61,6 87,11,3 99,30,9 96,70,Примечание: Х-ср. арифметическая, м-ошибка средней, n=Степень очистки IgG (табл. 7) в зависимости от величины рН варьировала от 45% до 85%. Установлено, что в условиях инкубирования при рН 3,0 и концентрации каприловой кислоты 0,3%-1% процент чистоты составил 70-80%.

Показано также, что эта тенденция сохраняется при рН 4,0. При рН 5,0 и 6,степень очистки IgG не отличалась от контрольных показателей, свойственных исходному раствору осадка, предназначенного к фракционированию. Процент выхода IgG при рН 3,0 и 4,0 находился в пределах 70-85%, а при рН 5,0 и выше – достигал 99%.

Таблица 7.

Процент выхода и процента чистоты IgG норки в надосадке в зависимости от условий экстракции осадка с помощью каприловой кислоты рН Показатели Концентрация каприловой кислоты, % качества IgG- обогащенной 0,3 0,5 1,фракции 3 % чистоты 70,6 0,7 75,6 1,1 80,7 1,% выхода 80,4 1,5 80,2 1,6 70,9 1,4 % чистоты 75,1 1,6 80,4 1,4 85,6 1,% выхода 85,2 1,5 75,7 1,3 80,51,5 % чистоты 50,21,2 56,71,3 45,81,% выхода 95,31,6 97,10,8 99,10,Примечание: Х-ср. арифметическая, м-ошибка средней, n=Электрофоретический анализ образцов надосадочных фракций и осадков, полученных в процессе фракционирования, свидетельствует, что даже при использовании неагрегирующих (не осаждающих) концентраций каприловой кислоты (0,3-0,5%) в составе нерастворившихся белков всегда присутствовал IgG. Наименьшее содержание альбуминов в IgG обогащенной фракции характерно для экстракции при рН 3,0 и 4,0. В условиях более высоких значений рН белковый спектр надосадка не отличим от такового в контроле.

На основании полученных данных оптимальными условиями экстракции IgG из осадка при помощи каприловой кислоты являются 0,5-1% концентрация кислоты и интервал рН от 4,0 до 5,0.

Биологические свойства субстанции иммуноглобулинового биопрепарата Проблема производства инфекционно безопасных биопрепаратов крови, с точки зрения предотвращения передачи вирусных инфекций, до сегодняшнего дня остается актуальной (Панов, 2004). Ее сущность заключается в невозможности обеспечить безопасность сырья, используемого для производства препаратов крови, только проведением скрининговых тестов.

Помимо этого необходимо использовать специальные технологические стадии в производстве, обеспечивающие инактивацию и(или) удаление вирусных частиц в процессе фракционирования плазмы (сыворотки) крови (WHO Technical Report Series, №924, 2004). С точки зрения вирусной природы заболевания, типа вируса алеутской болезни норок и его широкой распространенности среди звероводческих хозяйств была изучена возможность получения инфекционно безопасных биопрепаратов крови. Плазму (сыворотку) крови заготавливали от норок имеющих соответствующие клинические симптомы заболевания алеутской болезнью и дающих положительную реакцию в РИЭОФ (реакция иммуноэлектроосмофореза). Изготовление иммуноглобулиновых биопрепаратов осуществляли с помощью технологии, включающей изложенные в предыдущих разделах способ заготовки и хранения сырьевой закладки, а также с использованием стадий фракционирования риванолом и каприловой кислотой. С целью безопасности и профилактики распространения гемотрансфузионным путем алеутской болезни норок при применении биопрепарата, с разрешения национального контролирующего органа, был проведен необходимый комплекс профилактических противоэпизоотических мероприятий. С учетом инкубационного периода алеутской болезни норок от 30 дней до 2-х лет (Сюрин и др., 1998), наблюдение за животными продолжалось в течение 4-х месяцев после введения иммуноглобулинового биопрепарата, с периодическим исследованием образцов сыворотки крови на наличие антител к вирусу алеутской болезни норок. На протяжении всего периода исследования у животных не было выявлено положительных реакций в РИЭОФ. В течение всего срока наблюдения у животных также не было выявлено клинических признаков заболевания алеутской болезнью норок. С учетом фармакокинетики всасывания препарата и периода полувыведения иммуноглобулина G из кровяного русла (который составляет в среднем 21 день) исследовали наличие положительной реакции в РИЭОФ образцов сыворотки крови норок на 3, 10, 15, 20 и 30 день после введения иммуноглобулинового биопрепарата. Несмотря на положительную реакцию на наличие антител против вируса алеутской болезни норок в образцах 3-х серий препарата, противовирусные антитела во всех образцах сыворотки крови норок не были обнаружены. С помощью ДИД изучили наличие иммунного ответа на введение иммуноглобулинового биопрепарата представителям семейства куньих (хорек, соболь). Исследовали образцы сывороток хорьков и соболя против иммуноглобулина G норки на 3, 10, 15, 20 и 30 день после введения. Наличия преципитационных полос не обнаружено.

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»