WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |

Индивидуальные образцы иммуносывороток объединяли, если в иммуноэлектроферезе с IgG норки формировалась единственная дуга преципитации в области подвижности -глобулинов при активности антител в пределах 1/16 – 1/32. В оптимизацию анализа входило определение стандартного разведения синтезированного ИПК. Для этого в течение ночи адсорбировали иммуноген (IgG норки) при постоянной концентрации белка мкг/мл общепринятым способом. Стандартным разведением ИПК анти-IgG норки считали такое его разведение, которое в прямом методе анализа обеспечивало формирование оптической плотности ОП493 = 1,2 0,1 с субстратом ОФД. На основе ИПК анти-IgG норки в стандартном разведении конструировали прямой метод иммуноферментного анализа.

Установлено, что чувствительность прямого варианта ИФА составляла 9,8 нг/мл. Изменения оптической плотности и достоверные различия ее значений определяют линейный интервал градуировочной зависимости.

Линейная часть градуировочной зависимости находилась в интервале 9,8 - нг/мл, а рабочая (нелинейная часть) соответствовала концентрациям вплоть до 10 мкг/мл. Для оценки неспецифической сорбции использовали альбумин норки и IgG различных видов животных и человека. Использовались концентрация альбумина норки – 10 мкг/мл, концентрации видовых IgG составили 1,25 и 10,0 мкг/мл. Уровень неспецифической сорбции ИПК антиIgG норки на адсорбционно иммобилизованный альбумин норки составил 0,078±0,011 ед. оптической плотности. Что демонстрирует незначительную сорбцию в пределах допустимых значений. Значения сорбции ИПК на иммобилизованные видовые IgG варьировали в достаточно широких пределах от 0,082±0,010 до 0,587±0,05 при концентрации IgG 1,25 мкг/мл и от 0,095±0,011до 0,887±0,062 при концентрации IgG 10,0 мкг/мл. Необходимо подчеркнуть, что прямой метода анализа ИФА непосредственно в аналитической биохимии не используется. В данном случае его применение сводилось к оптимизации конкурентного ИФА и выявлению уровня гомологии видовых IgG среди животных одного и того же семейства в условиях максимально возможного лимитирования ИПК анти-IgG.

На основании предварительных результатов, полученных в прямом методе ИФА, конструировали конкурентный метод анализа при концентрации 1 мкг/мл адсорбционно иммобилизованного IgG норки, а ИПК анти-IgG норки использовали в стандартном разведении (ОП493 = 1,2±0,1). Градуировочная зависимость гомологичных IgG находилась в пределах 2,4 нг/мл – 5 мкг/мл.

Чувствительность набора определена на уровне 39,1 нг/мл. Линейный участок кривой находится в интервале 39,1 – 625 нг/мл. Холостая проба, содержащая мкг/мл альбумина норки, формировала оптическую плотность 1,205±0,098.

При использовании твердофазных методов за счет адсорбционной иммобилизации IgG невозможно обеспечить необходимую для количественного определения точность анализа (Войцеховский, 1988). Также невозможно достичь необходимого показателя качества набора в тесте на открытие ввиду диффузионных ограничений и протекания реакции на границе раздела фаз (Вербов, 1988). Результаты определения важнейшего показателя – отсутствие перекрестных реакций с близкородственными белками или белками со сходными структурами с точки зрения наличия подобных антигенных детерминант – определить не представляется возможным. Данные, полученные с помощью ДИД или иммуноэлектрофореза, не могут полностью удовлетворять необходимым требованиям. Поскольку чувствительность данных методов примерно на три порядка ниже по сравнению с методами, основанными на иммуноферментном варианте анализа. На основании вышеизложенного были проведены исследования, представленные в следующем разделе, направленные на изучение иммунологического сходства видовых IgG с использованием методологических принципов анализа и соответствующих подходов представленных в настоящем разделе.

С учетом изложенного использовали следующие исследовательские подходы к проведению экспериментов: 1) при постановке ДИД вместо иммуносыворотки, использовали фракцию IgG кролика, специфичную к IgG норки при постоянной концентрации белка 10 мг/мл; 2) объектом исследования служили видовые образцы IgG в биохимически чистой форме, гомогенные в ПААГ-электрофорезе, без олигомеров и фрагментов целевого белка; 3) постановка ИФА базировалась на оптимизированных вариантах схем, с соответствующими градуировками и контролями, воспроизводимыми в каждом планшете; 4) градуировочные зависимости и результаты анализа фиксировались непосредственно, без использования математических моделей обработки информации (Войцеховский, 1988).

Исследование антигенной структуры видовых IgG в гомологичной системе анализа (IgG норки – анти-IgG норки) Проведено изучение антигенного строения видовых IgG с помощью иммунореагента на основе поликлональных антител с целью определения усредненных значений иммунологического сродства. Для сравнительных исследований IgG различных видов животных и человека были использованы варианты иммунопреципитационных и иммуноферментных методов анализа.

При постановке ДИД использовали небольшие модификации. Вместо цельной антисыворотки использовалась фракция IgG с концентрацией 10 мг/мл, выделенная из пула иммуносывороток, специфичных к IgG норки. Для повышения чувствительности в состав агарозы вводили ПЭГ до концентрации 3 %, а преципитаты окрашивали с помощью амидочерного 4В Кэтти и др., 1991. В прямом варианте ИФА в системе анализа IgG норки – ИПК анти-IgG норки исследовали калибровочные пробы, приготовленные на основе видовых IgG. Гомологичные и гетерологичные калибранты использовали также в прямом конкурентном методе.

Таблица Уровень иммунологического сходства иммуноглобулина G норки и IgG различных животных и человека ДИД Прямой ИФА, ОПП Конкурентный Животное ИФА, ОПК титр % х± % х± % Норка 1/64 100 1,214±0,153 100 0,582±0,05** Соболь 1/64 100 0,907±0,110* 73 0,933±0,087** Хорек 1/64 100 0,782±0,080* 62 1,014 ±0,073** Лиса 1/16 25 0,327±0,043* 22 1,173±0,089 Песец 1/16 25 0,248±0,036* 15 1,192±0,110 1,Собака 1/16 25 0,192±0,017* 10 1,196±0,077 0,Человек 1/8 12,5 0,112±0,015* 3 1,178±0,091 3,Баран 1/1 (цельная) 1,6 0,111±0,014* 3 1,191±0,085 1,Лошадь 1/1 (цельная) 1,6 0,108±0,013* 3 1,207±0,086 1,Корова 1/1 (цельная) 1,6 0,098±0,011* 2 1,182±0,107 2,Свинья 1/1 (цельная) 1,6 0,092±0,010* 1 1,205±0,084 0,Крыса 1/1 (цельная) 1,6 0,091±0,009* 1 1,203±0,084 0,0 0,078±0,011 1,205±0,фон (САН, 10 (отсутствие мкг/мл) конкурента) Примечание: Х - ср. арифметическая, – ср. квадратичное отклонение, n=6;

ОПП – оптическая плотность образцов при концентрации адсорбционно иммобилизованных IgG 10 мкг/мл; ОПК – оптическая плотность образцов IgG при их постоянной концентрации (156 нг/мл), которая обеспечивает в гомологичной системе анализа (IgG норки) ~50% ингибирование;

* - достоверные различия по сравнению с гомологом (IgG норки) при уровне значимости р < 0,** - достоверные различия по сравнению с фоном (отсутствие конкурентов) при уровне значимости р < 0, На основании результатов, представленных в табл. 2 можно сделать вывод, что анализ на основе иммунопреципитации выявляет сходство практически всех видовых IgG. При этом разницы между IgG представителей семейства куньих (норка, соболь, хорек) не выявлено, следовательно, образцы сравнения характеризуются 100% иммунологической идентичностью поскольку титр в гомологичной системе анализа составил 1/64 для всех представителей куньих. Если сравнивать видовые IgG семейства куньих в прямом методе ИФА, то уровень сродства различен для IgG соболя, IgG хорька.

Об этом свидетельствуют прежде всего профили градуировочных зависимостей, воспроизведенных для образцов IgG семейства куньих (табл. 2, рис. 3). В табл. 2 представлены численные значения различий в антигеном строении образцов сравнения, которые вычислены по формуле как отношение в % величины ОП493 гетерологичного IgG к ОП493 гетерологичного IgG при максимально возможной (10 мкг/мл) концентрации антигена. Оставшиеся видовые IgG связывали ИПК анти-IgG норки на уровне значений контроля.

норка 1,соболь хорек лиса песец 0,собака 0,человек баран 0,лошадь 0,корова свинья крыса 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 IgG, нг/мл Рис. 3. Градуировочные зависимости гомологичных и гетерологичных IgG в прямом варианте ИФА В условиях лимитирования концентрации аналитических антител в составе ИПК антиIgG норки (стандартное разведение связывающего иммунореагента при постоянной концентрации антигена (1 мкг/мл) моделировали конкуренцию за центры связывания избытка антигеннородственных (гетерологических IgG) белков. Если сравнивать видовые IgG в конкурентном анализе в условиях лимитированных ОП концентраций, то различия между образцами сравнения носят достоверный характер. При сравнении одинаковых концентраций IgG соболя и хорька, соответствующих концентрации IgG норки (156 нг/мл) и 50%-ому ингибированию в градуировочной зависимости, уровни сродства для гетерологичных образцов составили 44 и 32 %, соответственно (табл. 2, рис. 4).

Таким образом, иммунопреципитационный метод и прямой метод ИФА показали наличие гомологии (перекрестных реакций) с различными гетерологичными IgG, в то время как наиболее адекватный метод для оценки гомологии (прямой конкурентный ИФА) выявил наличие перекрестных реакций с IgG норки только у представителей семейства куньих.

1,НОРКА СОБОЛЬ 1,ХОРЕК лиса песец 0,собака человек 0,баран 0,лошадь корова 0,свинья крыса 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 IgG, нг/мл Рис. 4. Градуировочные зависимости гомологичных и гетерологичных IgG в прямом конкурентном варианте ИФА Способ получения и хранения фракции IgG из плазмы (сыворотки) крови Для производства биопрепаратов из плазмы крови используются различные способы заготовке сырья и его хранения. В ходе проведенного исследования изучалась возможность создания способа заготовки сырья включающего в себя возможность длительного хранения без использования энергоемких технологий (типа глубокой заморозки), совмещенной с созданием условий способствующих инактивации вирусных частиц. В рамках этой задачи исследовалась возможность хранения заготовленной плазмы (или сыворотки) крови при обработке ее фенолом с последующим фракционированием при помощи сульфата аммония. Фенол обладает бактерицидными и вирусинактивирующими свойствами. Сульфат аммония считается реагентом ОП способным длительно сохранять биологическую активность молекул белка, следовательно сохранять их нативную структуру.

40%-й раствор фенола в глицерине вносили до его конечной концентрации 0,3%, 0,5%, 1,0% при заготовке плазмы или сыворотки крови и выдерживали в течение 5 суток при температуре (10+2) С. В процессе хранения контролировали бактериальный рост в заготовке, отбирая ежедневно пробы на протяжении 5 суток. Пробы высевали на МПА. При концентрации фенола 0,3% наблюдалось уменьшение количества колоний по сравнению с контролем. В то же время в отобранных образцах при концентрациях фенола 0,5% и 1,0% бактериальный рост отсутствовал. На основании полученных результатов определен минимальный интервал концентраций фенола, обеспечивающих бактериостатическое действие, который составляет 0,5-0,7%.

Далее в плазму (сыворотку) крови вносили сульфат аммония и доводили его до концентрации 50% от насыщения с целью максимального осаждения иммуноглобулина G. Полученную таким образом фенольно-сульфатную суспензию хранили при температуре (10+2)0С. Согласно полученным данным электрофореза в ПААГ практически весь IgG представлен в осадке.

Из полученных суспензий в течение 12 месяцев через определенные интервалы времени отбирали пробы и проводили исследования по нескольким показателям. Было изучено влияние предложенного способа хранения сырьевой заготовки на активность антител. Уровень активности антител определяли при помощи метода ИФА по изменению титра антител к овальбумину - у предварительно иммунизированных овальбумином норок и к клещевому энцефалиту - у человека в пуле образцов абортно-плацентарной сыворотки. Полученные данные свидетельствуют, что активность антител после 12 месяцев хранения сохраняется практически на исходном уровне вне зависимости от вида сырья и 12 месяцев хранения не влияют на биологические функции белков, в частности IgG. Так титр антител норки к овальбумину сохранялся в течение изученного срока хранения на уровне 1/6400-1/12800, а титр к клещевому энцефалиту в абортно-плацентарной сыворотке оставался в интервале 1/12800-1/25600.

Изучалась возможность микробного роста в процессе хранения сырья, пробы на посев отбирались с интервалом месяц. Результаты демонстрируют отсутствие бактериального роста в отобранных образцах в течение 12 месяцев хранения сырьевой заготовки. Следовательно, в процессе хранения создаются условия предотвращающие рост микроорганизмов и накапление бактериальных пирогенов в заготовленном сырье.

В процессе производственной заготовки плазмы (сыворотки) крови пушных зверей происходит гемолиз эритроцитов и других клеточных компонентов крови, что приводит к загрязнению сырьевой заготовки различными клеточными протеазами. Что ведет в конечном итоге к нарушению нативной структуры молекул целевых белков и к их дальнейшей фрагментации.

Ферментативную активность протеаз в фенольно-сульфатной суспензии оценивали с помощью определения трипсиноподобной активности в надосадочном растворе. Полученные результаты свидетельствуют о снижении активности протеолитических ферментов в суспензии по сравнению с контрольными показателями в образцах исходного сырья в среднем 35-40 раз.

Таким образом, в предложенном варианте хранения создаются условия, способствующие снижению протеазной активности и уменьшению повреждающего действия различных протеаз на целевые белки.

Перевод фенольно-сульфатной суспензии в полуфабрикат IgG для дальнейшей работы осуществляли с помощью различных методов. Наиболее оптимальным и универсальным для дальнейших манипуляций по фракционированию является осадок белка, полученный осаждением ПЭГ. ПЭГ считается наиболее мягким и неиногенным осадителем, в связи с этим не препятствует последующему использованию нехроматографического методов фракционирования и различных вариантов хроматографической очистки IgG.

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»