WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

Аналитические процедуры осуществляли с использованием реактивов SIGMA" (США), Serva" (Германия), "Reanal" (Венгрия): Меркаптоэтанол-2, Акриламид 4-кристализованный, Персульфат аммония, Глицин, Бисакриламид, ТЕМЭД, Додецилсульфат-Na, Три(оксиметил)аминометан, Агароза со средним показателем электроэндоосмоса. При синтезе иммунопероксидазного коньюгата, специфичного к IgG норки, использовали пероксидазу хрена с RZ3,0 «SIGMA» (США), периодат натрия и боргидрид натрия. Для нехроматографического фракционирования коллоидных растворов белка использовали реагенты, предназначенные и разрешенные к использованию Национальным контролирующим органом (НКО) РФ в производстве фармацевтических биопрепаратов: ПЭГ 4000 (ФС 42-3337-96), риванол (этакридин лактат, ФС 42-2799-91), каприловая кислота (ТУ 6-09-52975), этанол (ФС 42-3072-00).

Методы исследования Хроматографическое фракционирование при получении IgG человека и норки выполняли в колоночном варианте с учетом рекомендаций и методологических подходов, изложенных в монографиях и оригинальных исследованиях (Protein Purification. Handbook. 2001; The Protein Protokols.

Handbook. 2002; Остерман, 1985).

Электрофоретический анализ проводили в соответствии с базовыми методами Лэммли и Дэвиса в градиентном 5-25% ПААГ в нативных и восстанавливающих условиях (Garfin, 1990).

Иммуноэлектрофорез проводили согласно рекомендациям, изложенным в монографии изложенным в монографии под редакцией Фримеля (1987).

Ферментативную активность протеаз в фенольно-сульфатной суспензии оценивали методом на основе определения трипсиноподобной активности в надосадочном растворе по методу Эрлангера (Erlanger et al., 1961) в модификации В.А. Шатерникова (Шатерников, 1966).

Концентрацию общего белка определяли биуретовым методом (Досон и др., 1991).

Определение остаточных концентраций сульфата аммония оценивали по титру SO42- в качественной реакции с ионами бария по образованию осадка или появлении опалесценции (в зависимости от концентрации сульфат-ионов).

Метод дробного осаждения белков использовали при нехроматографическом фракционировании плазмы (сыворотки) крови с применением сульфата аммония, ПЭГ 4000, риванола, каприловой кислоты, этанола. Осадок и надосадок получали центрифугированием суспензии при 5000 об/мин в течение 30 мин., на центрифуге ОПН-8 или РС-6.

Препаративную схему фракционирования плазмы (сыворотки) отрабатывали в заводских условиях при объемах сырьевой закладки в пределах 190-206 литров плазмы (сыворотки) крови.

Получение антисывороток осуществляли стандартным образом (Dresser, 1986) с небольшими модификациями.

Мониторинг за процессом иммунизации осуществляли методом двойной иммунодиффузии (ДИД) по Ouchterlony O. (1962).

Синтез иммунопероксидазных конъюгатов для проведения ИФА осуществляли согласно M.B Wilson, R.K Nakane (1978). Иммуноферментный анализ оптимизировали для непрямого и прямого конкурентного методов (Егоров, Дзантиев, 1991).

Определение иммуноглобулинов класса IgM, IgA в различных фракциях.

определяли методом радиальной иммунодиффузии по G. Manchini (1965) с использованием наборов стандартных моноспецифических сывороток против иммуноглобулинов человека (IgA, IgM) производства «ИмБио» в соответствии с методическими рекомендациями [Фримель, 1987].

Оценку микробного роста в фенольно-сульфатной суспензии в процессе хранения проводили при помощи посева образцов на мясо-пептонный агар в чашках Петри. Подсчёт колонии микроорганизмов проводили через 2-5 суток инкубации. Результаты параллельных высевов из одной пробы суммировали и определяли среднее число колоний, выросших при высеве на одной чашке.

Процент чистоты IgG для иммунизации, оценивали электрофорезом в градиентном 5-25% ПААГ в нативных и восстанавливающих условиях с последующим денситометрированием гелей на приборе ImageScaner «Amersham Biosciences» (Великобритания) в красном свете. Минимальное количество белка в треке, при котором максимальная оптическая плотность в пятне достоверно отличалась от фонового сигнала – 0.5 мкг. В иммуноэлектрофорезе чистота оценивалась по отсутствию преципитационных полос отличных от IgG.

Процент чистоты IgG при оптимизации стадий очистки нехроматографическими и хроматографическими способами рассчитывали как отношение количества IgG во фракции (определенного с помощью сконструированного в лаборатории набора на основе прямого конкурентного ИФА) к количеству общего белка во фракции.

Фактор очистки рассчитывали как отношение процента чистоты IgG во фракции к проценту чистоты IgG в исходном сырье.

Процент выхода рассчитывали как отношение количества IgG во фракции к количеству IgG в исходном сырье.

Процент иммунологической гомологии (сходства) рассчитывался в в двойной иммунодиффузии (ДИД) как обратный титр специфических IgG, получаемый в гомологичной системе, который принимали равным 100 %, а связывание всех гетерологичных иммуноглобулинов оценивали как долю от соответствующего связывания гомологичного IgG.

% сходства в ДИД = Г/Н х 100%, где Г – величина обратная титру видовых IgG; Н – величина обратная титру IgG норки.

Расчет уровня иммунологического сходства в прямом ИФА основан на определении соотношения оптических плотностей (ОП) при максимальных (мкг/мл) концентрациях иммобилизованных IgG различных животных и человека.

Уровень иммунологического сходства рассчитывали в %, по формуле:

ОПК - К % в прямом ИФА = ---------------- х 100%, где ОПН – К К – величина оптической плотности фона в пробе при концентрации сывороточного альбумина норки 10 мкг/мл; ОПК - оптическая плотность образцов видовых IgG при их постоянной концентрации 10 мкг/мл; ОПН – оптическая плотность при концентрации IgG норки 10 мкг/мл Расчет уровня иммунологического сходства в прямом конкурентном ИФА основан на определении соотношения оптических плотностей при значениях оптической плотности, обеспечивающей 50% уровень ингибирования (связывания ИПК анти-IgG норки).

Уровень иммунологического сходства рассчитывали в %, по формуле:

К – ОП конкурента % в конкурентном ИФА:= --------------------------- х 100%, где К – ОП50 норки К – величина оптической плотности в отсутствие конкурентов, ОП50 – оптическая плотность при концентрации IgG норки, обеспечивающая 50% уровень связывания ИПК антиIgG норки, ОП конкурента – оптическая плотность образцов видовых IgG при их постоянной концентрации Статистическая обработка результатов. При анализе и обобщении результатов исследований использовали методы статистической обработки, общепринятые в биологии. Достоверными считали различия при уровне значимости р0,05. Полученные результаты подвергали статистической обработке средствами программы Microsoft Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Получение стандартизованных форм видовых IgG Задачей проведенных экспериментов, представленных в данном разделе было создание универсальной схемы выделения IgG с необходимым уровнем электрофоретической гомогенности и мономерных по составу фракций белка.

С целью получения очищенных и конформационно нативных образцов видовых IgG использовали реагенты и методы фракционирования с минимальным белок-денатурирующим эффектом. Осаждение IgG из пула плазмы (сыворотки) крови осуществляли с помощью ПЭГ при концентрации 15% и значениях рН среды равной 8,0±0,1.

Далее обогащенные IgG осадки растворяли в соответствующих буферных растворах с необходимыми значениями рН и ионной силы для проведения стадий хроматографической очистки. Для дальнейшей очистки были использованы различные виды сорбентов. На основе протеин А-сефарозы выделяли фракцию IgG. Полученные продукты имели высокую степень чистоты (92-97%), но процент выхода целевого белка варьировал в достаточно широком интервале (75-95%). От дальнейшего применения аффинного сорбента на первых стадиях очистки для использования в универсальной схеме получения высокоочищенной формы видовых IgG, было решено отказаться ввиду малой сорбционной емкости сорбента, достаточно жестких условий десорбции (низкое значение рН) и отсутствие сорбции определенных подклассов IgG некоторых видов животных на протеин-А. Относительно высокий процент выхода IgG (78-94% и 80-92% для фенил-сефарозы и бутилтойоперл, соответственно) и низкая селективность хроматографии (56-75% чистоты) позволяют заключить, что данная стадия не имеет дальнейших перспектив в рамках цели проводимых исследований. Сравнительный анализ данных показал, что анионообменное фракционирование позволяет получать IgG с наиболее высоким выходом (75-83%) и степенью чистоты в пределах 8596%. При этом в составе IgG фракций в иммуноэлектрофорезе регистрируется трансферрин, IgA и IgM. Для повышения уровня чистоты целевого белка в дальнейших исследованиях изучалась возможность анионообменной сорбции IgA на основе различий в изоэлектрических точках IgG и примесных белков. За счет варьирования рН и ионной силы уравновешивающего буферного раствора определяли условия, при которых из состава фракции, представленной на 8596% IgG происходит сорбция IgA. Далее изучали количественное соотношение белок-сорбент с целью минимизации сорбции IgG при установленном значении рН и ионной силы уравновешивающего буферного раствора. Указанный эффект достигался при использовании 0.05 М трис-HCl уравновешивающего раствора, рН 8.5, в соотношении 200 мг стандартизированной (85-96% чистоты) IgG фракции/мл сорбента. Таким образом, первая стадия анионообменной хроматографии (табл. 1, 3.2) имеет своей задачей получение фракции IgG при уровне очистки 85-96%. Вторая (ключевая) стадия (табл. 1, 3.3) позволяет удалять из очищенной формы IgG примеси IgA. Полагаем, что снижение выхода видовых IgG на 10-13% не является принципиальным, т.к. данная стадия позволяет удалить IgA, сходный по молекулярной массе целевому белку, а также IgM и трансферрин, включая гем-производные, в т.ч.

модифицированные гемом молекулы иммуноглобулина G. Стадия гельхроматографии (табл. 1, 3.4.) предназначена для выделения мономерных форм IgG без их олигомеров, фрагментов, денатурированных форм белка и остаточных концентраций ПЭГ.

Таблица Характеристика лабораторных схем выделения особо чистых форм IgG норки, хорька, соболя, человека.

Шифр Стадия % % Фактор стадии чистоты выхода очистки Анионообменная хроматография 3.1 Осаждение ПЭГ (15% рН 8.0) 48-55 91-97 3,8-5,3.2 Анионообменная хроматография 1 85-96 75-83 6,8-9,(сорбция примесных белков: рН 6.5, 0.0175 М натрий-фосфатный буфер;

соотношение масса белка/объем сорбента не превышало 50 мг/мл) 3.3 Анионообменная хроматография 2 90-96 60-70 7,2-9,(сорбция примесных белков: рН 8.5, 0.М трис-HCl буфер; соотношение масса белка/объем сорбента составляло мг/мл) 3.4 Гель-хроматография 96-99 35-54 7,7-9,Рис.1 Электрофореграммы стадий выделения иммуноглобулина G:

1 - фракция, полученная при осаждении 15 %-ным ПЭГ при рН 8.0 (стадия 3.1);

2 – после анионообменной хроматографии 1 в режиме сорбции примесных белков (стадия 3.2);

3 – после анионообменной хроматографии 2 в режиме сорбции примесных белков (стадия 3.3.);

4 – после гель-хроматографии хроматографии (стадия 3.4) На рисунке 1 (1-4) в качестве примера приведены электрофореграммы последовательных стадий фракционирования сыворотки крови для получения стандартизованной формы IgG.

Образцы очищенных форм видовых IgG представлены на рис. Рисунок 2. Электрофореграмма образцов стандартизованных форм IgG человека и животных.

Электрофорез проводился в градиентном (3-25%) полиакриламидном геле, количество белка на трек 40 мкг (в первом треке 60 мкг). Образцы восстановлены меркаптоэтанолом.

1 – плазма крови человека, 2 - IgG барана, 3 - IgG лошади, 4 – IgG соболя, 5 – IgG человека, 6 – IgG лисы, 7 – IgG норки, 8 – IgG собаки, 9 – IgG свиньи, 10 – IgG песца, 11 – IgG курицы, 12 – IgG хорька. Alb – альбумин, H – тяжелая цепь иммуноглобулина, L – легкая цепь иммуноглобулина Изучалось влияние длительного хранения очищенных образцов IgG на их свойства. С этой целью образцы IgG хранили при (8±2) С в присутствии сульфата аммония при его конечной концентрации 50% от насыщения.

Установлено, что в течение года в составе образцов IgG формировались олигомеры, регистрируемые в ПААГ-электрофорезе и с помощью гельхроматографии на геле сефадекса G-200. Через 2 года хранения фрагментирование целевых белков нами не обнаружено, а уровень олигомеров возрос до 3%. Не исключено, что процесс олигомеризации мономерных форм индивидуальных белков обеспечивает им новые свойства, в т.ч. на уровне представительства антигенных детерминант в составе сформировавшихся агрегатов. Изменение антигенных свойств образцов IgG определяли в прямом и прямом конкурентном ИФА, используя для конструирования аналитических иммуносорбентов и градуировочных зависимостей образцы хранения и их мономерные формы. В прямом варианте ИФА чувствительность анализа была одинаковой и составляла 9,8 нг/мл в системе взаимодействия с адсорбционно иммобилизованными IgG норки и специфическими ИПК-антиIgG.

Аналогичный вывод следует из сравнительных исследований на основе прямого конкурентного ИФА, в котором чувствительность 39,1 нг/мл была одинаковой независимо от использования мономерных форм IgG или их образцов хранения. Изучение свойств образцов хранения этих белков позволяет обсуждать их применение в качестве стандартов при исследовании производственных серий иммуноглобулиновых и альбуминовых биопрепаратов, а также ИПК антиIgG, в т.ч. из иммуноферментных диагностикумов для выявления антител из класса IgG.

Представленные результаты позволяют сделать заключение, что предложенная универсальная схема выделения видовых IgG позволяет получить высокоочищенную мономерную форму иммуноглобулина G из плазмы (сыворотки) различных животных и человека. В предложенных условиях хранения возможна олигомеризация IgG до 3%, но, тем не менее, она не влияет на его поведение в различных вариантах ИФА.

Разработка лабораторного набора для определения IgG норки В разработку набора для определения IgG норки на базе иммуноферментного метода входило изготовление необходимых иммунореагентов. Выделение IgG норки для проведения иммунизации проводили на основе разработанной и описанной ранее схемы. Специфичность иммуносыворотки и соответствующего набора обеспечивали качеством иммуногена, схемой иммунизации и контролем в иммуноэлектрофорезе.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»