WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |

На правах рукописи

КУЗНЕЦОВ АЛЕКСАНДР ИВАНОВИЧ СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ И ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНА G КУНЬИХ Специальность 03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань – 2009 2

Работа выполнена на кафедре биохимии и биотехнологии ГОУВПО Удмуртский государственный университет

Научный консультант: кандидат биологических наук, Барсуков Алексей Константинович

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Дзантиев Борис Борисович, кандидат биологических наук, Уразов Наиль Гумерович

Ведущая организация: Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт гриппа СЗО РАМН, г. Санкт-Петербург.

Защита состоится «29» октября 2009 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 212.081.08 при ГОУВПО Казанский государственный университет по адресу: 420008, Казань, ул. Кремлевская 18, аудитория 211.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. Н.И.

Лобачевского Казанского государственного университета

Автореферат разослан «29» сентября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор З.И. Абрамова 3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Успехи физико-математической и физико-химической биологии обеспечили принципиально новое качественное состояние теоретической медицины и вошли как прикладное знание в современные биомедицинские технологии. С этих позиций значимый интерес представляет международный исследовательский проект «Протеом плазмы крови». Наличие в составе плазмы от 3020 до 9504 индивидуальных белков позволяет рассматривать этот сложный коллоидный раствор как обобщенную многофакторную субстанцию, в которой только один белок-IgG имеет четко выраженную направленность в отношении чужеродной генетической информации (States et al., 2006; Omenn, 2006). На основании фундаментальных представлений о роли антител в элиминации бактерий в составе IgG полагают целесообразным присутствие IgM (Garbett et al., 1989; Werdan et al., 1996). Структурно-функциональные особенности IgA и его целесообразное присутствие в составе иммуноглобулиновых биопрепаратов также учитывается прикладной наукой при проектировании научно-технических нововведений в технологии фракционирования плазмы (сыворотки) крови (Wadsworth et al., 1976). Вместе с тем медицинской генетикой выявлены индивидуальные особенности, согласно которым в человеческой популяции всегда присутствуют отдельные индивидумы, неспособные к биосинтезу IgA. В клинической практике такое генетическое своеобразие выявляется по биосинтезу антител, специфичных к IgA после парэнтерального введения иммуноглобулина, в составе которого присутствует IgA (Eijkhout et al., 2003). Известно, что олигомеры индивидуальных белков, в частности IgG, способны к активации системы комплемента (Boughton et al., 1990; Nachbaur et al., 1997). Целый ряд работ опубликован о фракционировании плазмы с целью обеспечения инфекционной безопасности конечного продукта (Klein et al., 2005; Horowitz et al., 2004;

Burnouf et al., 2000; Панов, 2004). Однако процессы инактивации инфекционных агентов как правило влияют на конформацию белка, что в конечном итоге выражается в олигомеризации и фрагментации молекулы IgG (Le Moli et al., 1989; Hetherington et al., 1984). С точки зрения экономических подходов актуальным вопросом является изучение возможности использования межвидовых субстанций IgG в клинической практике с минимизированным нежелательным (антиген-индуцирующим) эффектом (Mathews, 2008; Martin et al., 2008; Burnouf et al., 2004). К настоящему времени стало возможным компьютерно-аналитическое сопоставление аминокислотных и нуклеотидных последовательностей IgG млекопитающих, в т.ч. выявление межвидовых особенностей их строения (Naumoff, 2005; Finn et al.,. 2006; Abhiman et al., 2006). Однако для практической биохимии методы информатики имеют определенные ограничения. Во-первых, невозможно однозначно предсказать ориентацию экспонированных участков пептидных цепей IgG, поскольку проблематика фолдинга до настоящего времени не полностью раскрыта (Dill et al., 2007; Moore, 2007). Во-вторых, при сопоставлении нуклеотидных последовательностей геномов не учитываются посттранскрипционные модификации и последствия, обусловленные белок-денатурирующим эффектом, присущим схемам выделения и очистки IgG. Следовательно, актуален прямой иммунохимический подход, позволяющий по совокупности эпитопов проводить сравнительный анализ видовых IgG. Очевидно также, что схема выделения образцов IgG должна обеспечивать препаративную наработку индивидуальных белков без использования агентов и приемов, обладающих денатурирующим эффектом.

Цель исследования - заключалась в создании исследовательской схемы для определения антигенных характеристик IgG близкородственных видов в рамках научно-технического задела, касающегося фракционирования плазмы (сыворотки) крови для получения иммуноглобулиновой субстанции с надлежащим уровнем инфекционной и биологической безопасности Задачи исследования:

Разработать исследовательскую технологию получения стандартизованных форм образцов IgG человека и животных;

Создать лабораторный набор на основе иммуноферментного анализа для определения IgG норки;

Оценить различные иммунологические подходы, направленные на описание антигенных характеристик IgG некоторых зоологических видов, формирующих семейство куньих;

Апробировать способы заготовки и получение IgG-обогащенных фракций для отработки условий проведения стадий, обладающих инактивирующим и элиминирующим действием на инфекционные агенты.

Научная новизна.

Разработаны оригинальные схемы выделения видовых IgG и условия их хранения с минимальным уровнем (до 3%) образования олигомерных форм индивидуальных белков.

Создана исследовательская схема для оценки антигенных свойств IgG близкородственных видов.

Определены приемы крупномасштабного фракционирования гемолизной плазмы (сыворотки), полученной из трупной крови норки при которых сохраняется нативная конформация IgG.

Подобранны условия и определены концентрации риванола и каприловой кислоты позволяющие проводить наработку биопрепаратов IgG из полуфабриката обогащенного IgG.

Отсутствие передачи вирусного начала в составе иммуноглобулинового биопрепарата (Иммуно Н) подтверждено клинико-лабораторными исследованиями экспериментальных серий, изготовленных из инфекционноопасного сырья.

Практическая значимость.

Результаты исследований легли в основу разработки, согласования и утверждения в соответствии с порядком, действующим в России, нормативнотехнической и технологической документации на изготовление экспериментальных серий препарата «Иммуно Н»:

технические условия (ТУ 9382-003-43683877-03) на препарат “Иммуно Н”, 27 стр.;

экспериментально-производственный регламент на технологию производства фармацевтического биопрепарата “Иммуно Н”, №001515-ОП, 300 стр.;

наставление по применению препарата “Иммуно Н” для норок № 13-4-03/0692; № 001515-ОП от 06.03.03 г., 2 стр.

На пилотный проект по производству экспериментальных серий препарата «Иммуно Н» был получен федеральный аттестат № 886 от 02.04.03 г.

Из экспертного заключения ФГУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») следует, что по показателям качества экспериментальные серии препарата «Иммуно Н» аналогов в России не имеют. Результаты проведенных исследований по разработке схем получения стандартизованных форм видовых иммуноглобулинов заложены в проект «Инструкции по изготовлению и контролю видовых IgG человека и животных». В настоящее время материалы и натуральные образцы проходят согласование и испытания в ФГУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ»).

На предложенный способ хранения и получения IgG-обогащенной фракции для изготовления биопрепаратов крови выдан патент на изобретение №2338375 «Способ хранения плазмы или сыворотки крови для получения иммуноглобулиновых и альбуминовых биопрепаратов».

Положения, выносимые на защиту:

1. Исследовательская технология получения стандартизованных форм IgG животных и человека.

2. Разработка лабораторного набора на базе иммуноферментного анализа для определения IgG норки в сыворотке крови, полуфабрикатах и бросовых осадках.

3. Иммунологические принципы выявления гомологии видовых IgG в рамках проблематики использования в клинике гетерологичных иммуноглобулинов.

4. Оценка приемов фракционирования плазмы (сыворотки) крови для проектирования технологии изготовления IgG.

Апробация работы. Результаты исследований представлены на Региональной конференции биохимиков Урала, Поволжья и Западной Сибири, 20-21 сентября 2001 г., г. Ижевск; на Международной конференции «Биотехнология на рубеже тысячелетия», 12-15 сентября 2001 года., г. Саранск;

на 5-ой Российской университетско-академической научно-практической конференции, г. Ижевск, 2001 г.; на 6-ой Российской университетскоакадемической научно-практической конференции, г. Ижевск, 2003 г.; на II Евразийском конгрессе по медицинской физике и инженерии “Медицинская физика - 2005”, Москва, 2005; на I съезде физиологов СНГ, Сочи, 2005; на Международной конференции инженерного образования, 25-29 июля 2005 г., г.

Гливиц (Польша); на II Всероссийском форуме «Здоровье нации – основа процветания России», Москва, 2006; на Второй международной научнопрактической конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности», Санкт-Петербург, 2006; на XIX Международной научно-технической конференции «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии», Уфа, 2006; на Третьей международной научно-практической конференции «Исследование разработка и применение высоких технологий в промышленности», Санкт-Петербург, 2007; на Четвертой международной научно-практической конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности», Санкт-Петербург, 2007; на VI конференции иммунологов Урала, Ижевск, 2007.

Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 10 работ. В соответствии с порядком, действующим в РФ, разработан, согласован и утвержден комплект нормативно-технической и технологической документации на изготовление и изучение ветеринарного иммуноглобулинового препарата нового поколения «Иммуно Н»: Технические условия ТУ (ТУ 9382-003-43683877-03, 27 стр.), Экспериментальнопроизводственный регламент производства на препарат «Иммуно Н» (№001515-ОП, 300 стр.) и наставление по применению препарата «Иммуно Н» (№ 13-4-03/0692; № 001515-ОП, 2 стр.).

Структура и объем диссертационной работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 125 страницах, содержит рисунков и 19 таблиц. Список используемой литературы включает источников, в том числе 154 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В проведенном исследовании использовали нижеследующие материалы, реагенты и комплектующие.

Получение плазмы (сыворотки) крови Заготовку сырья для получения плазмы (сыворотки) крови пушных животных проводили в зверохозяйствах «Можгинское» (Республика Удмуртия), «Бирюли» и «Кощаковское» (Республика Татарстан). Кровь норки (Mustela vision), хорька (Mustela putorius), соболя (Martes zibellina), песца (Alopex lagopus), лисы (Vulpes vulpes.) собиралась во время проведения плановых забоев животных. Сбор крови осуществляли с использованием антикоагулянта (9% Na3PO4) в соотношении кровь/антикоагулянт 2:1. Далее кровь разделяли на форменные элементы крови и плазму с помощью сепаратора (Ж5-АС-2Ж). Плазма (сыворотка) крови человека предоставлена Республиканской станцией переливания крови г. Ижевска (Республика Удмуртия). Полученные плазма и сыворотка крови подвергались в дальнейшем обработке фенолом (1%) и сульфатом аммония (50% от насыщения) (патент на изобретение №2338375). Сыворотка домашних животных (лошади, коровы, барана, свиньи, собаки) предоставлена Можгинской районной ветеринарной лабораторией, полученная из сельскохозяйственных предприятий Можгинского района (Республика Удмуртия), сыворотка крысы из вивария Удмуртского госуниверситета. Полученные кровь и сыворотка использовались для выделения образцов IgG.

Оборудование и реактивы Приборная база исследований представлена вертикальным абсорбциометром Multiskan Ascent (Termo Fisher Scientific, Финляндия), жидкостным хроматографическим комплексом низкого давления (Pharmacia, Швеция), укомплектованным коллектором фракций, проточным детектором, регистратором, градиентным формером и комплектом колонок, установкой для электрофореза и иммуноэлектрофореза Hoefer (Amersham Biosciences, Великобритания), денситометром гелей ImageScaner (Amersham Biosciences, Великобритания).

Хроматографические стадии выполняли с помощью сорбентов:

аффинных - протеин А-сефароза CL 6B (Pharmacia, Швеция); гидрофобных - бутил-тойоперл (Toyo Soda, Япония), фенил-сефароза (Pharmacia, Швеция);

ионообменных - DE-52 (Whatman, Великобритания); гель-хроматографию на сефадекс G-200 (Pharmacia, Швеция). Стадии концентрирования белка и удаления низкомолекулярных примесей проводились с помощью ультрафильтрационной установки на полых волокнах УВА-ПА-0,1 с номинально отсекаемой молекулярной массой 10 кД. Для проведения ИФА использовали планшеты «Nunc» (Дания).

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»