WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Полученные нами данные (табл. 4, рис. 2) свидетельствуют о смешанном типе перекреста. Так, непараллельность калибровочных графиков в области их линейности (рис. 2) на основе гомологичного и гетерологичных IgG животных из семейства псовых позволяет обсуждать наличие идентичных антигенных детерминант в составе IgG собаки, песца и лисицы.

Гетерологичные IgG из семейства псовых не обеспечивают близких численных значений ОП в интервале концентраций гомолога 2,5 – 5,0 мкг/мл (табл. 4, рис. 2). Соответствующие ОП493 при концентрации 5 мкг/мл видовых IgG из семейства псовых составили (0,21±0,02), (0,33±0,02) и (0,41±0,02), соответственно, для образцов собаки, песца и лисицы. При этом наиболее демонстративные результаты ОП493, на основе которых воспроизводятся параллели грудуировочных зависимостей, характерны для интервала концентраций IgG псовых от 1,5 до 5 мкг/мл. Очевидна также тенденция к конкуренции остальных IgG и прежде всего со стороны IgG норки (табл. 4, рис. 2). По-видимому, в условиях лимита концентрационных соотношений, предусмотренных условиями реакции, в составе ИПК антиIgG собаки будут присутствовать антитела к антигенным детерминантам гомолога, т.е. к антигенным детерминантам, которых нет в составе IgG песца и лисицы.

Идентификацию численных значений иммунологического сродства осуществляли с учетом градуировочных зависимостей, которые для прямого и конкурентного варианта ИФА составили 4,88 - 625 нг/мл и 19,5 - нг/мл, соответственно. В прямом методе ИФА иммунологическое сходство оценивали как отношение в % оптических плотностей гетерологичного и гомологичного антигенов при их постоянной концентрации 10 мкг/мл. В прямом конкурентном методе использовали линейную часть градуировочной зависимости 19,5 - 625 нг/мл. Разработанный нами лабораторный набор не в полной мере отвечал требованиям, предъявляемым к количественному анализу. Поэтому сравнивали различия оптических плотностей и их достоверность при одинаковых концентрациях видовых IgG (220 нг/мл), обеспечивающих 50% ингибирование за счет гомологичного IgG (табл. 4)..

При сравнении одинаковых концентраций IgG песца и лисицы, соответствующих концентрации IgG собаки (220 нг/мл) и 50%-ому ингибированию в градуировочной зависимости, уровни сродства для гетерологичных образцов составили 84 и 65 %, соответственно.

Таблица Уровень иммунологического сродства видовых IgG животных в системе анализа (IgG - антиIgG собаки) ДИД Прямой ИФА, ОПП Конкурентный ИФА, Животное ОПК титр % х± % х± % Собака 1/64 100 1,125±0,129 100 0,659±0,015** Песец 1/64 100 1,063±0,082 90,0 0,748±0,048** Лиса 1/64 100 0,892±0,073* 80,1 0,855±0,035** Норка 1/16 25 0,347±0,043* 26,9 1,148±0,075** 12,Человек 1/8 12,5 0,176±0,023* 10,5 1,186±0,061 5,Бык 1/4 6,25 0,134±0,043* 6,5 1,177±0,076 7,Баран 1/4 6,25 0,154±0,062* 8,4 1,196±0,078 3,Лошадь 1/4 6,25 0,123±0,021* 5,5 1,179±0,076 Свинья 1/4 6,25 0,141±0,053* 7,0 1,195±0,097 4,Крыса 1/3 12,2 (цельная) 0,193±0,021* 1,188±0,Мышь 1/3 10,5 (цельная) 0,176±0,019* 1,201±0,фон 1,218±0,0,065±0,(отсутствие (САС, 10 мкг/мл) конкурента) Примечание: Х - ср. арифметическая, - среднее квадратичное отклонение, n=6;

ОПП – оптическая плотность образцов при концентрации адсорбционно иммобилизованных IgG 10 мкг/мл; ОПК – оптическая плотность образцов IgG при их постоянной концентрации (220 нг/мл), которая обеспечивает в гомологичной системе анализа (IgG собаки) ~50% ингибирование; * - достоверные различия по сравнению с гомологом (IgG собаки) при уровне значимости р < 0,05; ** - достоверные различия по сравнению с фоном (отсутствие конкурентов) при уровне значимости р < 0,05.

1,1,0,0,0,0,0,0 2 4 6 8 мкг/мл песец собака лисица норка человек бык баран лошадь свинья крыса К Рис. 1. Градуировочные зависимости гомологичных и гетерологичных IgG в прямом варианте ИФА 1,1,1,0,0,0,0,0,0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 нг/мл собака песец лиса норка человек бык баран лошадь свинья крыса мышь К1 КРис. 2. Градуировочные зависимости гомологичных и гетерологичных IgG в прямом конкурентном варианте ИФА.

ОП ОП Оптимизация реакции сополимерной модификации IgG собаки Активированную форму сополимера и образцы IgG собаки инкубировали при рН 9,5 в течение 1-18 часов. В процессе модификации определяли скорость изменения рН инкубационной среды через равные промежутки времени (табл. 5).

Таблица Скорость изменения рН в процессе реакции модификации при различных соотношениях белок/полимер Время реакции, Скорость снижения рН, ед./час час mod 1/2, mod 1/5, mod 1/10, mod 1/15, mod 1/20, х± х± х± х± х± 1-3 0,57±0,15 0,61±0,03 0,7±0,209 0,78±0,19 0,82±0,4-6 0,31±0,09 0,386±0,11 0,443±0,131 0,496±0,151 0,517±0,7-8 0,152±0,11 0,18±0,14 0,245±0,173 0,261±0,139 0,274±0,Примечание: mod – модифицированный IgG собаки с соответствующим соотношением белок/полимер; х – средняя арифметическая скорости; - стандартное отклонение.

Дальнейшие исследования были направлены на изучение физикохимических свойств модифицированных форм IgG при тех же мольных соотношениях белок/полимер. Оценивали мутность и вязкость растворов до и после модификации. Метод определения мутности основан на определении кажущего поглощения света с длиной волны 540 нм и относится к косвенным методам контроля за размерами молекул. Установлено, что мутность растворов возросла в 1,5 - 3 раза по мере увеличения избытка совиаля.

Тенденция к увеличению мутности говорит об увеличении средних молекулярных размеров коньюгатов по мере увеличения мольного избытка полимера. При этом вязкость раствора инкубационной среды возрастает незначительно: на 0,02-0,04 ед. при максимальных (1/15 и 1/20) мольных избытках модификатора.

В следующей серии экспериментов была предпринята попытка выделения сополимерно модифицированных форм IgG с помощью эксклюзионной хроматографии на гелях типа сефадекса G-200 (сефакрила S200 или S-300). Установлено, что уже 2-кратный мольный избыток совиаля изменяет профиль эксклюзионной хроматографии. Из-за структурных особенностей модификатора в наших исследованиях такой подход следует признать малоинформативным.

Для разработки метода оценки полноты реакции модификации на уровне соотношений нативная/модифицированная форма IgG использовали электрофорез в градиентном ПААГ (5-25 %). В аналитическом варианте электрофоретическому фракционированию подвергали восстановленные и невосстановленные пробы в диссоциирующих условиях. В диссоциирующих условиях невосстановленные пробы нативных и модифицированных IgG представлены на рисунке 3.

Рис. 3. Электрофореграмма образцов IgG: невосстановленные пробы (40 мкг) в диссоциирующих условиях:

1. Нативная форма IgG собаки;

2. Модифицированный IgG собаки, мольное соотношение белок:совиаль – 1:2;

3. Модифицированный IgG собаки, мольное соотношение белок:совиаль – 1:5;

4. Модифицированный IgG собаки, мольное соотношение белок:совиаль – 1:10;

5. Модифицированный IgG собаки, мольное соотношение белок:совиаль – 1:20.

В отличие от нативного образца модифицированные формы IgG представлены более широкой диффузной полосой в интервале от концентрирующего геля до области, близкой к подвижности немодифицированного белка. Заметно также, что модифицированные белки обладали меньшей электрофоретической подвижностью. Указанная закономерность зависела от мольного избытка совиаля. Из электрофореграммы, приведенной на рис. 3, можно утверждать, что при мольном 20-кратном избытке, по-видимому, происходит наиболее полная модификация IgG (имеется ввиду отсутствие немодифицированных форм IgG).

В следующей серии экспериментов модифицированные формы IgG собаки подвергали электрофорезу в диссоциирующе-восстанавливающих условиях. Полученные электрофореграммы сканировали и результаты сканирования приведены в табл. 6. Количественный анализ полученных электрофореграмм показал, что уже при 2-х кратном избытке полимера большая часть белка оказывается модифицированной, при этом доля свободного иммуноглобулина составляет 39,7 % от общего количества IgG.

С увеличением мольного соотношения белок/полимер до 1/20 наблюдается постепенное снижение доли свободного IgG и, соответственно, повышение доли высокомолекулярных комплексов в коньюгате.

Таблица Соотношение нативной и модифицированной форм IgG собаки в зависимости от мольного соотношения белок/совиаль, % (по результатам электрофореза в ПААГ в диссоциирующих восстанавливающих условий) Образцы с разным соотношением Нативный IgG Модифицированный белок/полимер IgG Нативный IgG 98,1 1,9 (олигомеры) 1/2 39,7 60,1/5 28,4 71,1/10 7,1 92,1/15 6,7 93,1/20 6,4 93,Исследование биохимических и биологических свойств нативных и сополимерно модифицированных форм IgG собаки Одним из следствий ковалентного связывания белка с полимерами является повышение их устойчивости термоинактивации или к условиям инкубирования с выраженным денатурирующим эффектом. В связи с изложенным, дальнейшие исследования касались изучения термостабильности коньюгатов. Нативный и модифицированный IgG в о присутствии гентамицина (10 мг/мл) прогревали при 60 С в течение часов. В прогретых нативных образцах наблюдалась выраженная опалесценция и формирование осадка. Тогда как в образцах с модифицированными IgG опалесценции не наблюдалось. В отличие от нативной формы IgG модифированные формы выдерживают термообработку даже при минимальном 2-х кратном избытке совиаля.

Изменения антигенных свойств модифицированных образцов IgG собаки исследовали методом ДИД по Ухтерлони, используя специфичные IgG (антиIgG собаки) кролика. С увеличением степени модификации иммуноглобулина происходит закономерное понижение уровня антигенного сходства конъюгатов с нативным иммуноглобулином. Характерная для нативного IgG чувствительность иммуноанализа (64) при исследовании модифицированных образцов снижается. Так при 2-х и 5-ти кратных избытках совиаля и наличия в составе IgG до 60,3 и 71,6 % модифицированных форм целевого белка чувствительность уменьшилась до титра 32. При 15-ти и 20-ти кратном избытке полимера исследуемый показатель снизился, соответственно, до 16 и 8.

В дальнейших исследованиях использовали прямой и прямой конкурентный ИФА. Результаты, представленные в табл. 7, показали, что по мере увеличения степени модификации IgG снижается уровень связывания ИПК антиIgG.

Таблица Степень иммунохимического сходства нативного и модифицированных форм IgG собаки в прямом методе ИФА, в % Соотношение х± Р белок/полимер Нативный IgG 100 - Mod 1/2 24,2±5,3 <0,Mod 1/5 18,52±2,7 <0,Mod 1/10 11,1±2,1 <0,Mod 1/15 2,5±1,9 <0,Mod 1/20 0 <0,Примечание: n = 6; х – среднее арифметическое; - стандартное отклонение;

P – достоверность различий.

Сополимер винилпирролидона с диацеталем акролеина является гидрофильной матрицей. Не исключено, что модифицированные формы IgG приобретают гидрофильные свойства и, как следствие этого, изменяется изотерма сорбции модифицированных образцов. С учетом изложенного, в следующей серии экспериментов нативный и модифицированный формы IgG исследовали прямым конкурентным методом (табл.8) Таблица Степень иммунохимического сходства нативного и модифицированных форм IgG собаки в прямом конкурентном ИФА, в % Схема 1 Схема Соотношение белок/полимер х± Р х± Р Нативный IgG 100 - 100 - Mod 1/2 43,1±11,6 <0,05 48,7±5,3 <0,Mod 1/5 38,4±10,12 <0,05 46,24±4,79 <0,Mod 1/10 31,3±9,1 <0,05 43,0±12,3 <0,Mod 1/15 19,1±4,4 <0,05 23,7±6,5 <0,Mod 1/20 12,1±4,6 <0,05 17,0±8,0 <0,Примечание: n = 6; х – среднее арифметическое; - стандартное отклонение;

P – достоверность различий.

Из результатов, приведенных в табл. 8 следует, что при 2-х кратном мольном избытке совиаля антигенное сродство IgG снижается на 56,9 %.

При 20-ти кратном мольном избытке уровень антигенной гомологии модифицированного и нативного образцов IgG составил 12 %.

Обнаруженные различия в уровнях антигенной гомологии модифицированных IgG (табл. 7 и 8) возможно объяснить методологией ИФА. Известно, что адсорбционная иммобилизация белков на поверхности твердой фазы обусловлена гидрофобными связями межу белком и полистиролом. По-видимому, модификация IgG придает гидрофильные свойства белку, вследствие чего изотерма сорбции нативных и модифицированных образцов определяется различными количественными закономерностями. Следовательно, в конкурентном ИФА результаты исследования более адекватно отражают реальный уровень изменения антигенных свойств, обусловленных модификацией.

В следующей серии экспериментов изучали влияние модификации IgG, специфичного к яичному альбумину. Исследования выполняли с помощью непрямого метода ИФА, который проводили с помощью общепринятой схемы: адсорбционная иммобилизация яичного альбумина с последующей инкубацией нативной или модифицированных форм IgG собаки, специфичного к яичному альбумину, и индикация комплекса при помощи ИПК антиIgG собаки. Результаты исследования представлены в таблице 9.

Таблица Антигенсвязывающая активность нативных и модифицированных IgG собаки, специфичных к яичному альбумину, до и после термоинактивации Стадии ОП493 в непрямой схеме ИФА исследования при концентрации IgG 625 мкг/мл, x± Nat 1/2 1/5 1/10 1/15 1/До 2,918 0,852 0,647 0,539 0,141 0,инактивации ± ± ± ± ± ± 0,02 0,06 0,04 0,021 0,01 0,После 0,248 0,072 0,58 0,502 0,134 0,инактивации ± ± ± ± ± ± 0,015 0,03 0,03 0,017 0,006 0,Остаточная активность 8,5 84,5 89,6 93,1 95 112,(%) Примечание: x – среднее арифметическое; - стандартное отклонение;

P – достоверность различий.

Установлено, что с увеличением степени модификации закономерно снижается антигенсвязывающая активность IgG собаки, специфичного к яичному альбумину. При 15-20-ти кратном мольном избытке совиаля антигенсвязывающая активность модифицированных IgG практически исчезает.

За антигенсвязывающую активность молекулы иммуноглобулина ответственны Fab-фрагменты, на конце которых сосредоточены гипервариабельные участки полипептидной цепи. Отдельные аминокислотные остатки в этих участках специфически взаимодействуют с эпитопами антигена. Таким образом, уменьшение уровня антительной активности модифицированных форм IgG собаки, специфичных к яичному альбумину, по сравнению с их нативной формой свидетельствует о структурно-функциональных эффектах модификации в районе Fabфрагмента молекулы иммуноглобулина, приводящее к экранированию части антигенсвязывающих участков или к нарушению их структуры. Кроме того, на антительную активность существенное влияние может оказать связывание полимера в районе Fc-фрагмента.

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»