WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Иммунохимическое сходство IgG собаки с другими видовыми IgG определяли с помощью двойной радиальной иммунодиффузии (ДИД) по Ухтерлони, конкурентных и неконкурентных методов твердофазного иммуноферментного анализа (Егоров и др. 1991).

Исследовали влияние модификации сополимером Nвинилпирролидона с диацеталем акролеина (совиаль) на биохимические, иммунохимические и иммунологические свойства IgG кролика, специфичного к IgG собаки. Реакционоспособные альдегидные группы в составе сополимера получали путем кислотного гидролиза акролеинового звена. Химическую модификацию иммуноглобулина проводили в условиях образования азометиновых связей между альдегидными группами сополимера и -аминогруппами лизина IgG (рН 9,5-9,6) в течение 2-12 часов при комнатной температуре, варьируя мольное соотношение компонентов IgG/совиаль от 1/2, 1/5, 1/10, 1/15, 1/20 при концентрации белка 5 мг/мл. В связи с нестабильностью азометиновых связей проводили восстановление боргидридом натрия. Фракционной состав модифицированного белка анализировали методом электрофореза в градиентном ПААГ (5-25%) в диссоциирующих восстанавливающих условиях. Окраску белков проводили с использованием красителя Кумасси бриллиантовый голубой R-250 в концентрации 0,04 %.

Нативные и модифицированные формы IgG собаки сравнивали в иммунопреципитационном и иммуноферментном методах анализа.

Статистическая обработка данных по нескольким экспериментам проводилась согласно правилам вариационной статистики. Достоверность различий определяли, используя t-критерий Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Выделение электрофоретически гомогенных и нативных (мономерных в гель-хроматографии) образцов IgG из плазмы (сыворотки) крови собаки, песца, лисицы.

С целью получения очищенных и конформационно нативных образцов IgG собаки, песца и лисицы использовали методы фракционирования с минимальным белок-денатурирующим эффектом. Исходно с помощью ПЭГ формировали фракции, обогащенные IgG. Нехроматографический осадок глобулинов для дальнейших исследований растворяли в буфере с необходимым составом и ионной силой (табл. 1) Таблица 1.

Оптимизация первой стадии хроматографической очистки иммуноглобулина G собаки, песца и лисы с использованием различных сорбентов.

Шифр Название сорбента % % стадии чистоты выхода 0 Осадок - глобулинов, полученный с помощью 43-52 96 и ПЭГ более 1.1 Протеин-А сефароза (сорбция IgG-обогащенной 90-97 80-фракции: 20 мМ натрий-фосфатный буфер, рН 8,0; десорбции–100 мМ натрий-цитратный буфер рН 4,0; соотношение масса белка/объем сорбента не превышало 5 мг/мл) 1.2 Фенил-сефароза (сорбция IgG-обогащенной 46-70 80-фракции: 80 г/л (NH)2SO4; десорбции– 0,15 М NaCl; соотношение масса белка/объем сорбента не превышало 5 мг/мл) 1.3 Бутил-тойоперл (сорбция IgG-обогащенной 53-75 76-фракции: 120 г/л (NH)2SO4; десорбции – 0,15 М NaCl; соотношение масса белка/объем сорбента не превышало 5 мг/мл) 1.4 DE-52 (сорбция примесных белков из IgG- 80-95 60-обогащенной фракции: рН 6,5, 0,0175 М натрийфосфатный буфер; соотношение масса белка/объем сорбента не превышало 50 мг/мл) Использование аффинного сорбента (протеин А-сефарозы обеспечивало получение образцов IgG с максимальным уровнем чистоты (9097 %) и приемлемым выходом целевого белка (80-95 %). Аналогичные показатели получены с помощью анионообменной хроматографии в режиме сорбции примесных белков. Хроматография на основе гидрофобных сорбентов характеризовалась низкой селективностью (46-75 %) чистоты, а фенил-сефароза и неприемлемой сорбционной емкостью в отношении IgG (около 1 мг/мл сорбента). С учетом принципиально разных механизмов очистки IgG, свойственных аффинной и анионообменной хроматографиям, дальнейшую оптимизацию выделения целевого белка проводили в режиме сорбции примесных белков. За счет варьирования рН и ионной силы уравновешивающего буферного раствора определяли условия, при которых из состава фракции (1.4, табл. 1), представленной на 80-95 % IgG, происходит сорбция гема и, по-видимому, белков, в т.ч. IgG, модифицированных гемом.

Указанный эффект достигался при использовании 0,05 моль/л трис-HCl уравновешивающего раствора, рН 8,5, в соотношении 200 мг стандартной IgG (80-95 % чистоты) на 1 мл сорбента. Таким образом, первая стадия анионообменной хроматографии (табл. 2) имеет своей задачей получение фракции IgG (2.2., табл.2) на уровне очистки целевого белка в пределах 80-%. Вторая (ключевая) стадия позволяет удалять из очищенной фракции IgG целевой и примесные белки, модифицированные гемом. Стадия эксклюзионной хроматографии (2.4., табл. 2) предназначена для выделения мономерных форм IgG без олигомеров и фрагментов целевых белков, в т.ч.

без остаточных концентраций ПЭГ.

Таблица 2.

Характеристика лабораторной схемы выделения особо чистых форм видовых иммуноглобулинов G Шифр Стадия % % Фактор стадии чистоты выхода очистки 2.1 Осаждение ПЭГ 15% рН 8,0 43-52 91-99 2,6-5,2.2 Анионообменная хроматография 1 80-95 60-83 4,3-9,(сорбция примесных белков: рН 6,5, 0,0175 М натрий-фосфатный буфер;

соотношение масса белка/объем сорбента не превышало 50 мг/мл) 2.3 Анионообменная хроматография 2 90-98 46-73 4,9-9,(сорбции примесных белков: рН 8,5, 0,05 М трис-HCl буфер;

соотношение масса белка/объем сорбента составляло 200 мг/мл) 2.4 Эксклюзионная хроматография 96-99 22-54 5,1-9,Определение качества иммуносывороток и конструирование лабораторного набора для индикации IgG собаки Специфичность иммуносыворотки и сопряженного набора обеспечивали качеством иммуногена, схемой производства иммуносыворотки и системой контроля полученных иммунореагентов.

Серии контрольных проб, калибрантов и исследуемых образцов готовили из сульфатного концентрата целевых белков. Для этого аликвоты сульфатных суспензий IgG или альбумина вносили в 0,85 %-й раствор хлорида натрия до величины ОП280 = 0,7. Концентрацию IgG или альбумина определяли спектрофотометрически на основании мольного коэффициента поглощения с использованием эмпирических постоянных 1,4 и 0,66, соответственно, для IgG и альбумина. Далее необходимые концентрации образцов готовили с линейным инкрементом на основании шага 2.

В оптимизацию анализа входило определение стандартного разведения синтезированного ИПК. Для этого в течение ночи адсорбировали иммуноген (IgG собаки) при постоянной концентрации белка 1 мкг/мл общепринятым способом. Стандартным разведением ИПК антиIgG собаки считали такое его разведение, которое в прямом методе анализа обеспечивало формирование ОП495 = 1,2 0,1 с субстратом ОФД. На основе ИПК антиIgG собаки в стандартном разведении конструировали прямой метод иммуноферментного анализа. Растворы IgG с концентрацией белка 2,44 нг/мл – 10 мкг/мл подвергали адсорбционной иммобилизации с целью построения градуировочной зависимости. Контролем служили сывороточный альбумин собаки (10 мкг/мл) и видовые IgG (1,0 и 10,0 мкг/мл). Установлено, что чувствительность прямого варианта ИФА составляла 4,88 нг/мл, градуировочная зависимость находилась в интервале 4,88-625 нг/мл. При этом неспецифическая сорбция ИПК антиIgG собаки на адсорбционно иммобилизованный альбумин была в пределах нормы (0,066±0,007), а уровень специфических взаимодействий с видовыми IgG колебался в интервале от 1,125 0,129 до 0,071 0,019. Прямой метод анализа в аналитической биохимии самостоятельного значения не имеет. В настоящем исследовании полученные результаты прямой индикации IgG собаки и видовых образцов IgG служили основой для оптимизации прямого конкурентного метода и для выявления уровня гомологии видовых IgG среди животных одного и того же семейства.

Конкурентный метод ИФА обладает надлежащим уровнем специфичности. Максимальная специфичность анализа проявляется в условиях заданного лимита концентраций иммунореагентов в исходной реакционной среде. Указанный принцип соотношений аналитического иммуносорбента (IgG собаки) и детектирующего иммунореагента (ИПК антиIgG собаки) был использован при оптимизации прямого конкурентного метода ИФА. Концентрации калибрантов IgG собаки брали в интервале 2,– 5000 нг/мл. Установлено, что надлежащий наклон градуировочной зависимости находится в интервале концентраций конкурента 19,5 – нг/мл. При этом концентрации сывороточного альбумина собаки 1, 10 и мкг/мл не участвовали в конкуренции. Соответствующие оптические плотности образцов были на уровне холостой пробы, т.е. ОП493 холостой пробы равна 1,113 0,102, ОП493 альбумина при концентрации белка 1, мкг и 100 мкг/мл составили (1,15 0,09), (1,23 0,11) и (1,22 0,15), соответственно.

Влияние состава инкубационной среды на титр антител из класса IgG собаки С целью разработки технологических нововведений исследовали влияние инкубационной среды различного состава на активность (титр) антител из класса G собаки, иммунизированной яичным альбумином.

Результаты представлены в таблице 3.

Таблица Влияние состава среды и режима инкубирования на показатели титра антител из класса IgG собаки, специфичных к ЯА № Cостав среды и условия Титр антител в Удельный титр п/п инкубации эксперименте (расчетная величина) 1 0,8 % раствор риванола, рН 8,0 в 54300 течение 12 часов при температуре (102) оС 2 0,05 моль/л Na-ацетатном 54300 буферный раствор с 0,3 % каприловой кислоты при рН 5,в течение 12 часов при температуре (102) оС 3 0,05 моль/л Na-ацетатном 54300 буферный раствор с 0,3 % каприловой кислоты и 0,моль/л NaCl при рН 4,0 в течение 4 часов при температуре (182) оС 4 в 25 %-ном этаноле при рН 7,0 в 54300 течение 4 часов при температуре – 10 оС 5 0,15 моль/л раствор натрия 54300 хлорида в течение 12 часов при температуре (10±2) оС В пробирки, содержащие по 1 мл соответствующей инкубационной среды, вносили по 0,2 мл специфического IgG с концентрацией белка мг/мл. При инкубировании с этанолом к 30 %-ному охлажденному раствору спирта (– 10 оС) приливали в тех же соотношениях раствор специфического IgG, охлажденного до ~ 0 оС.

При всех условиях инкубирования специфических IgG определяли титр антител непрямым методом иммуноферментного анализа и рассчитывали удельный титр – титр/белок. Согласно данным, представленным в таблице 3, различные условия, в которых проводилась инкубация, не влияют на активность (количество) антител. В дальнейшем изложенные подходы были использованы в комплексном технологическом процессе производственного фракционирования плазмы крови псовых с целью разработки, согласования и утверждения в соответствии с порядком, действующим в России, нормативной документации на технологию производства препарата «Иммуно С».

Исследование антигенной структуры видовых IgG в гомологичной системе анализа (IgG собаки – антиIgG собаки) При определении специфичности прямого метода индикации IgG собаки установлена достаточно высокая степень сродства ИПК антиIgGсобаки к IgG песца и лисицы. В меньшей степени ИПК антиIgG собаки взаимодействовал с IgG норки. Конкретные представители семейства псовых (волчьих), а именно собака, песец и лисица, выбраны с учетом экономических соображений (разводятся в неволе для производства пушнины). Следовательно, их боенская кровь, может использоваться для получения субстанций иммуноглобулинов, на основе которых возможно организовать промышленный выпуск гетерологичных препаратов с надлежащим уровнем биологической безопасности.

В сравнительных исследованиях образцов видовых IgG апробировались иммунопреципитационные и иммуноферментные методы анализа. Небольшие модификации в постановке иммунопреципитации касались использования в качестве связывающего агента IgG-фракции, выделенной из пула иммуносывороток, специфичных к IgG собаки. В состав агарозы вводили ПЭГ до концентрации 3 %, а преципитаты окрашивали с помощью амидочерного 4В. В прямом варианте ИФА в системе анализа IgG собаки - ИПК антиIgG собаки исследовали калибровочные пробы, приготовленные на основе видовых IgG. Гомологичный и гетерологичные калибранты использовали также в прямом конкурентном методе. Образцы сывороточного альбумина собаки служили контролем.

Установлено (табл. 4), что иммунопреципитационный анализ позволяет выявить антигенное сродство практически всех видовых IgG. При этом IgG собаки, песца и лисицы по результатам ДИД неразличимы. С целью устранения фоновых эффектов вместо иммуносыворотки в реакции преципитации мы использовали фракцию специфических IgG.

Взаимодействие антиген – антитело регламентировали концентрацией специфического IgG (10 мг/мл) и концентрацией антигена 8-500 мкг/мл.

В прямом варианте ИФА (табл. 4, рис. 1) градуировочные зависимости воспроизводились для IgG собаки, песца и лисицы. Образцы IgG из семейства куньих (норка) также обладали сродством к ИПК анти-IgG собаки.

Однако величины ОП493 при концентрации адсорбционно иммобилизованных IgG 10 мкг/мл были на 10,0 % (песец), 19,9 % (лисица), 73,1 % (норка) ниже по сравнению с таковым показателем в гомологичной системе анализа.

Другие видовые IgG связывали ИПК анти-IgG собаки на уровне контрольных величин. Заслуживает внимания факт параллельности градуировочных зависимостей в интервале концентраций 2,5 – 10 мкг/мл воспроизводимых на образцах калибрантов семейства псовых (волчьих) (рис. 1). В методологической литературе интерпретация параллельности градуировочных зависимостей сводится либо к наличию структурно сходных либо идентичных антигенных детерминант.

При сравнении результатов исследований, полученных с помощью ДИД и прямого метода ИФА, наблюдается кажущееся несоответствие. В частности, чувствительность прямого ИФА составляет 4,88 нг/мл, чувствительность ДИД, как правило, на 3 порядка превышает аналогичный показатель при иммунопреципитации. Вместе с тем в ДИД зафиксировано иммунологическое сродство между, например, IgG собаки и IgG человека, а при использовании метода с большей чувствительностью результаты не столь очевидны (табл. 4). С позиций фундаментальной иммунологии взаимодействие с гетерологичными IgG возможно по двум структурно обусловленным обстоятельствам. Во-первых, одна и та же «гомогенная» популяция антител может реагировать с целым рядом не идентичных, но структурно сходным антигенных детерминант. В терминологии Tijssen (1985) такое иммунологическое взаимодействие характеризует индивидуальные белки как перекрестно реагирующие. Для белков, имеющих определенное количество идентичных антигенных детерминант, введен термин частичная перекрестная реактивность.

Иммуноперекрест, обусловленный структурно-сходными (не идентичными) антигенными детерминантами, графически представлен кривыми, параллельными линейной части градуировочных зависимостей, воспроизведенной в гомологичной системе конкурентного анализа.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»