WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

На правах рукописи

НЕСТЕРОВА ОЛЬГА ЮРЬЕВНА БИОХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАТИВНЫХ И МОДИФИЦИРОВАННЫХ ФОРМ IgG НЕКОТОРЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ СЕМЕЙСТВА ПСОВЫХ Специальность 03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань - 2009 2

Работа выполнена на кафедре биохимии и биотехнологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Удмуртский государственный университет

Научный консультант: кандидат биологических наук Барсуков Алексей Константинович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Коксин Владимир Петрович доктор медицинских наук, профессор Бутолин Евгений Германович

Ведущая организация: Учреждение российской академии наук Институт высокомолекулярных соединений РАН, г. Санкт-Петербург

Защита состоится «29» октября 2009 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 212.081.08 при Казанском государственном университете по адресу: 420008, Казань, ул. Кремлевская 18, аудитория 211.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И.

Лобачевского Казанского государственного университета им. В.И. Ульянова

Автореферат разослан «29» сентября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор З.И. Абрамова 3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Прогресс в секвенировании нуклеиновых кислот позволил разработать исследовательский подход, на основании которого фактологию палеонтологии, сравнительной и онтогенетической биохимии, можно увязать с особенностями первичной структуры ДНК и, тем самым, корректно обсуждать время и направление молекулярной эволюции живых систем (Киселев, 2000). Функциональный подход к организации генома клетки предполагает перевод одномерного (линейного) кода ДНК в трехмерную структуру белка. При этом разнообразие белковых вариантов и всевозможных комплексов на их основе значительно больше количества генов, кодирующих их полипептидные цепи (Карелин, 2005). С учетом обобщенной проблематики, объемлющей направления исследований, касающихся полиморфизма генов, степени их консерватизма и закономерностей фолдинга, фундаментальная концепция «в гомологии структур зашифрована аналогия функций» оказалась весьма плодотворной и в настоящее время (Свердлов, 2000). Полагают, что принципиальные закономерности фолдинга в общих чертах будут раскрыты в ближайшие десятилетия, после чего останется еще масса неясных деталей. С методологических позиций секвенирование белков является более трудоемким процессом по сравнению с секвенированием нуклеиновых кислот и, следовательно, создание «каталога протеинов» отодвигается на неопределенно долгое время. Для достоверной реконструкции филогенетического древа необходимо в сравнительных исследованиях использовать информацию о первичной структуре 15-30 индивидуальных белков отдельных зоологических видов. Выяснение гомологии аминокислотных последовательностей, механизмов фолдинга и описания конформационно-нативной структуры макромолекулы представляют собой безусловные составляющие целесообразного развития молекулярной иммунологии. Вместе с тем, интегральные результаты таких сугубо биохимических (молекулярно-биологических) подходов малоинформативны для расшифровки структуры антигенных детерминант и антигенного строения индивидуального белка в целом. Использование для этих целей моноклональных антител в технологии эпитопного картирования информационно обеспечивает выяснение частностей. Так, например, с помощью моноклональных технологий идентифицированы подклассы IgG собаки (Mazza et al., 1994). Однако вопрос о четко дифференцированной первичной структуре отдельных подклассов IgG остается дискуссионно открытым (Schur, 1987; Furukawa et al., 1991; Robert, 2001). Отметим также, что всестороннее описание антигенной структуры функционально-сходных белков в ряду вид, род, семейство, отряд, класс выходит за рамки фундаментальной науки. Именно фундаментальная составляющая исследования биологических объектов и процессов обеспечивает безопасность научно-технических нововведений. В целом ряде обзоров и оригинальных работ обсуждается комплексная проблематика использования функционально-сходных белков в качестве действующего начала фармацевтических биопрепаратов. Полагаем, что совершенствование методологии иммуноанализа позволит в объективных количественных критериях описать антигенную специфику функционально-сходных белков близкородственных видов. Для клинической практики такого рода исследования особенно актуальны (Burnouf et al., 2004; Trow et al., 2008;

Mathews, 2008). Иммунологические подходы при исследовании белков иммуноглобулинового ряда используются, как правило, в рамках проблематики филогении и совершенствования систематики (Гельфранд, Любецкий, 2003). В настоящей работе обсуждаются результаты экспериментов, нацеленных на выявление иммунологического сродства IgG близкородственных видов, формирующих семейство псовых. Для обеспечения исследований с надлежащим уровнем качества разработана технология c учетом принципа адекватности метода и модели. В частности, создана лабораторная схема получения видовых IgG в электрофоретически гомогенной форме без олигомеров и фрагментов целевого белка. Именно очищенные и мономерные (в гель-хроматографии) формы IgG использованы для выявления иммунологического сродства среди животных (собака, песец и лиса) из семейства псовых. В последующей серии экспериментов изучалась возможность конструирования сополимерно модифицированных форм IgG собаки. Актуальность такого рода исследований обусловлена целесообразным развитием теории искусственных антигенов, методологии многоцелевой модификации и ориентацией полученных результатов на создание предметного задела для:

- технологического совершенствования производства инфекционно безопасных иммуноглобулиновых биопрепаратов с удлиненным периодом полувыведения;

- использования в клинической практике гетерологичных IgG без индукции нежелательного иммунного ответа.

Цель исследования – оценка антигенной гомологии видовых IgG на основе экспериментальных результатов, полученных с помощью иммуноанализа (IgG - анти IgG собаки). Получение и характеристика модифицированных совиалем образцов IgG собаки в зависимости от степени модификации белка сополимером.

Задачи исследования:

В связи с поставленной целью решались следующие задачи:

1) Разработать лабораторную схему препаративной наработки IgG некоторых представителей из семейства псовых в электрофоретически гомогенной и конформационно нативной (хроматографически мономерной) форме.

2) Оптимизировать методы ИФА для индикации IgG собаки и выявления антител в составе специфического IgG собаки.

3) Провести сравнительное исследование антигенных свойств видовых IgG из семейства псовых.

4) Синтезировать сополимерно-модифицированные формы IgG собаки (химерные комплексы), изучить некоторые биохимические и биологические свойства химерных комплексов IgG собаки.

Научная новизна.

Создана универсальная исследовательская технология получения биохимически гомогенных и конформационно нативных форм IgG.

Предложен адекватный методологический подход для описания антигенных характеристик IgG животных, принадлежащих одному и тому же семейству.

Впервые в объективных количественных критериях выявлены различия антигенного строения при сравнении образцов IgG собаки, песца и лисы.

Оптимизирована реакция поликонденсации в системе взаимодействия IgG с активированной формой совиаля (сополимер винилпирролидона с диацеталем акролеина). Показана относительная резистентность сополимерно модифицированных форм IgG собаки к физико-химическим факторам с выраженным денатурирующим эффектом. Не установлен избирательный эффект модификации IgG совиалем. Есть основания полагать, что сополимерная матрица экранирует N –терминал и Fab-фрагменты IgG.

Нативные формы IgG собаки и IgG песца, или сополимерно модифицированные IgG собаки не вызывают индукции биосинтеза антител при их внутримышечном введении собакам и песцам. Установлено также, что иммуногенный потенциал сополимерно модифицированных IgG понижается с увеличением мольного избытка совиаля в химерном комплексе.

Практическая значимость.

Результаты исследования послужили основой для разработки, согласования и утверждения в соответствии с порядком, действующим в РФ, нормативно-технической и технологической документации на производство и исследование экспериментальных серий иммуноглобулинового биопрепарата: технические условия на препарат «Иммуно С» (ТУ 9382-00243683877-03); технологический регламент производства на препарат «Иммуно С» (№001516-ОП); наставление по применению препарата «Иммуно С» (№ 13-4-03/0690; №001516-ОП от 6 марта 2003 г.).

В рамках университетско-академического кластера в гермозоне GMP на заводских площадях организовано серийное производство экспериментальных серий препарата «Иммуно С» в рамках требований широких производственных испытаний (федеральный аттестат № 886 от апреля 2003 года), продукция сертифицирована (№ РОСС RU. ФБ01.

В08840). Из заключения ФГУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» следует, что по совокупным показателям качества препарату «Иммуно С» аналогов в России нет.

Положения, выносимые на защиту:

1. Исследовательская технология лабораторного производства видовых IgG семейства псовых.

2. Методология выявления антигенных различий видовых IgG из семейства псовых.

3. Модификация IgG сополимером винилпирролидона с диацеталем акролеина и изучение свойств модифицированного белка.

Апробация работы.

Результаты исследований представлены на Региональной конференции биохимиков Урала, Поволжья и Западной Сибири, 20-21 сентября 2001 г., г.

Ижевск; на 5-ой Российской университетско-академической научнопрактической конференции, г. Ижевск, 2001 г.; на 6-ой Российской университетско-академической научно-практической конференции, г.

Ижевск, 2003 г.; на I съезде физиологов СНГ, Сочи, 2005; на Международной конференции инженерного образования, 25-29 июля 2005 г., г. Гливиц (Польша); на XIX Международной научно-технической конференции «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии», Уфа, 2006; на Третьей международной научно-практической конференции «Исследование разработка и применение высоких технологий в промышленности», Санкт-Петербург, 2007; на Четвертой международной научно-практической конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности», Санкт-Петербург, 2007; на VI конференции иммунологов Урала, Ижевск, 2007.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ. В соответствии с порядком, действующим в РФ, разработан, согласован и утвержден комплект нормативно-технической и технологической документации на ветеринарный иммуноглобулиновый препарат нового поколения «Иммуно С», включающий технические условия ТУ (ТУ 9382002-43683877-03), технологический регламент производства на препарат «Иммуно С» (№001516-ОП) и наставление по применению препарата «Иммуно С» (№ 13-4-03/0690; №001516-ОП от 6 марта 2003 г.).

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследований, их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит 10 рисунков и 19 таблиц. Список использованной литературы включает 216 наименований.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Из сывороток крови собаки (Canis familiaris), песца (Alopex lagopus), лисицы (Vulpes vulpes), норки (Mustela lutreola), человека (Homo sapiens), быка (Bos taurus), барана (Ovis aries), лошади (Equus caballus), свиньи (Sus scrofa), крысы (Rattus norvegicus) и мыши (Mus musculus) выделяли IgG. На первой стадии фракционирования использовали осаждение полиэтиленгликолем (ПЭГ 4000) для получения фракций, обогащенных IgG или альбумином. Хроматографическое фракционирование осуществляли с использованием селективных сорбентов: аффинные - протеин А-сефароза CL 6B «Pharmacia» (Швеция), голубая сефароза CL 6B «Pharmacia» (Швеция);

гидрофобные - бутил-тойоперл «Toyo Soda» (Япония), фенил-сефароза «Pharmacia» (Швеция); ионообменные - DE-52, CM-32 «Whatman» (Великобритания). Хроматографию выполняли в колоночном варианте на основе обобщенных методологических принципов (Остерман, 1983) и рекомендаций фирм-изготовителей хроматографических сорбентов. На заключительной стадии всегда использовали эксклюзионную хроматографию на геле сефадекс G-200 «Pharmacia» (Швеция). Процент чистоты оценивали электрофорезом в градиентном 5-25% ПААГ в нативных и восстанавливающих условиях с последующим денситометрированием гелей на приборе ImageScaner «Amersham Biosciences» (Великобритания) в красном свете. Наличие примесных белков в полупродуктах и конечных продуктах выявляли также с помощью иммуноэлектрофореза по Грабару и Вильямсу в модификации Шейдеггера. Очищенные образцы целевых белков хранили при температуре (8+2) С в присутствии 50-70 % (от насыщения) сульфата аммония. В работе использовали стандартные образцы видовых IgG с 95-% чистоты.

Для получения антисыворотки, специфичной к IgG собаки, проводили иммунизацию беспородных кроликов высокоочищенным IgG собаки по схеме, предложенной Dresser D.W. Образцы индивидуальных иммуносывороток оценивали по титру и объединяли, если титр антиIgG cобаки был в интервале 1/16-1/32 (Фримель, 1987). Пулированную иммуносыворотку проверяли на специфичность в иммуноэлектрофорезе по методологии Грабар и Вильямс с микромодификацией Шейдеггер (Фримель, 1987).

Выделение IgG из сыворотки крови кролика, специфичной к IgG собаки, осуществляли осажением ПЭГ с последующими анионообменной (ДЭАЭ-целлюлоза) и эксклюзионной (сефадекс G-200) хроматографиями.

Коньюгацию IgG кролика с пероксидазой хрена (ПХ) осуществляли периодатным методом (Wilson, Nakane, 1978) с некоторыми модификациями. Полученный коньюгат стабилизировали и хранили в соответствии с рекомендациями (Montoya et al., 1987).

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»