WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 ||

М – маркер; 1-10 – индивидуальные изоляты Удивительным является сочетание диазотрофии с деструкторскими способностями в отношении широкого спектра специфических загрязнений, что впервые показано в нашей работе на примере аборигенных азотфиксаторов шламов. Выявленная нами способность десяти отобранных изолятов расти на среде с добавлением индивидуальных загрязнений или непосредственно шлама свидетельствует об адаптации азотфиксаторов к условиям шлама и демонстрирует их реальное участие в разложении загрязнений отхода. Недавно способность к деградации нефтяных углеводородов была обнаружена у некоторых представителей рода Azospirillum (Муратова с соавт., 2005).

С точки зрения увеличения доступности для растений других биогенных элементов оценивали способность растворять труднодоступные соединения фосфора, которая достаточно широко распространена среди исследуемых в нашей работе азотфиксирующих бактерий: 6 из 10 изолятов обладали данным свойством. В свою очередь, в работе Хьюзена было показано, что солюбилизация труднодоступных соединений фосфора – достаточно редкое явление среди бактериальных изолятов из категории PGPR: при скрининге было выявлено всего 4 положительных по данному признаку изолята из 14 (Husen, 2003).

Способность к синтезу фитогормонов, чаще всего ауксина – индолил3-уксусной кислоты (ИУК), является одним из основных ростстимулирующих свойств PGPR. Индольные соединения выявлены нами в культуральной жидкости всех исследуемых изолятов на уровне от 0,5 до 9,мкг/мл (рис. 8). Для представителей рода Azotobacter, выделенных из местообитания мангровых зарослей и рекомендованных в качестве основы морских биоудобрений, продукция ИУК в среднем составляла 11,5 мкг/мл (Ravikumar et al., 2004), в свою очередь для Pseudomonas, стимулирующих рост растений, характерен синтез ИУК на уровне 3-5 мкг/мл (Боронин, 1998).

Таким образом, многие коллекционные изоляты, выделенные из шламов, рассматриваются нами как потенциальные стимуляторы роста растений.

Рис. 8 Продукция индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) азотфиксирующими изолятами G1 G9 G10 G11 G12 G17 G20 G22 S1 Sизоляты Еще одним механизмом положительного влияния микроорганизмов на растения является способность подавлять рост фитопатогенов.

Совместное культивирование на твердой питательной среде изучаемых азотфиксаторов с различными фитопатогенными микромицетами и бактериями позволило выявить неспецифическое и специфическое в отношении отдельных фитопатогенов антагонистическое воздействие некоторых азотфиксирующих изолятов (табл. 2). Видоспецифичный антагонизм скорее всего связан с выделением в среду тех или иных антибиотиков, тогда как угнетающее действие на широкий спектр фитопатогенов может быть опосредовано продукцией сидерофоров (Боронин, 1998; Husen, 2003).

Таблица Антагонистическая активность изолятов по отношению к фитопатогенным микромицетам и бактериям (по зоне ингибирования роста фитопатогена, мм) G1 G9 G10 G11 G12 G17 G20 G22 S1 Sизолят патоген Aspergillus - - - - - 5 12 - - - niger Aspergillus 7 10 - - - 11 11 - - - sp.

Fusarium sp.

- - - - - 13 14 - - - Alternaria sp.

7 8 7 5 4 11 22 - - Ervinia 13 5 - - - 16 7 - - - caratovora Xantomonas 20 7 9 - 15 25 19 - - - solunocerum Pseudomonas - - - - - - - 3 - - syringae Продукция ИУК, мкг/мл Изоляты G17 и G20 проявили широкий спектр антигрибной активности на примере четырех наиболее распространенных видов фитопатогенных микромицетов (рис. 9).

а б в Рис. 9 Подавление роста фитопатогенных микромицетов Alternaria sp (а, б) и Aspergillus niger (в) изолятами G17 и GВ опыте с бактериальными фитопатогенами наибольшая антагонистическая активность изолятов выявлена в отношении Xantomonas solunocerum. Наибольшей антибактериальной активностью обладал изолят G17 (рис. 10).

Рис. 10 Подавление роста фитопатогенных бактерий изолятом G17: Erwinia caratovora (a), Xantomonas solunocerum (б).

а б Сравнивая полученные данные по величине зон подавления роста фитопатогенов с данными патентной литературы, можно сделать вывод, что некоторые исследуемые изоляты обладают высокой антагонистической активностью и могут играть роль в биоконтроле ряда заболеваний растений.

По интенсивности и спектру антагонистической активности в отношении грибных фитопатогенов изоляты G1, G9, G17 и G20 сопоставимы со штаммами бактерий Azotobacter vinelandii ИБ4 (Логинов с соавт., 2005) и Azotobacter chroococcum (Кандыба, Назаров, 2006), состоящих в основе запатентованных биологических препаратов для повышения урожайности сельскохозяйственных культур и их устойчивости к различным заболеваниям.

Эффекты бактеризации семян растений Бактеризация семян в сочетании с фитопатологической экспертизой позволила выявить влияние исследуемых азотфиксирующих изолятов на возбудители семенных инфекций, а также на прорастание семян растений.

По итогам анализа антагонистических свойств исследуемых диазотрофов (Табл. 2) были отобраны четыре наиболее активных изолята (G1, G9, G17 и G20) для оценки их потенциала в защите растений.

Предварительная фитоэкспертиза семян овса (Avena sativa L.) показала, что посевной материал в разной степени инфицирован следующими патогенами: Alternaria sp., Fusarium sp., Aspergillus sp., Penicillium sp. (рис.

11). Представители данных родов широко распространены в почвенных экосистемах (Шурхно с соавт., 2004) Рис. 11 Фитоэкспертиза семян овса В нашем эксперименте обработка семян смесью четырех отобранных изолятов позволила на 90% снизить зараженность семян и на 20% повысить их прорастание (табл. 3), что подтверждает их антагонистический потенциал.

Таблица Эффект бактеризации семян овса смесью изолятов G1, G9, G17, GВариант опыта Зараженные семена, % Проросшие семена, % С бактеризацией 5±3 99±Без бактеризации 67±8 85±Совокупный рост-стимулирующий потенциал изолятов азотфиксаторов мы оценили в лабораторном эксперименте при бактеризации семян растений и посеве их непосредственно в шлам.

В качестве наиболее устойчивых к шламу КОС растений ранее уже были отобраны овес (Avena sativa L.) и горох (Pisum sativum L.). Эффекты интродукции азотфиксаторов наиболее ярко выражены на горохе (Pisum sativum): продемонстрировано увеличение общей биомассы растений от 1,до 2,5 раз (рис. 12), при этом некоторые изоляты способствовали развитию корневой системы, стимулировали образование клубеньков.

Изоляты диазотрофов горох овес Рис. 12 Влияние бактеризации семян на рост гороха (Pisum sativum L.) и овса (Avena sativa L.) в химическом шламе Таким образом, расширенный скрининг на основании биохимических исследований и оценкой непосредственного влияния на рост растений в шламе позволили выявить пять биотехнологически перспективных изолятов - G1, G9, G10, G17 и G20, среди азотфиксаторов, выделенных из шламов.

Филогенетический анализ этих изолятов, основанный на последовательности гена 16S рРНК, позволил установить их систематическое положение и выявить родство с родами Pseudomonas и Enterobacter (рис. 13).

Рис. 13 Филогенетическое родство исследуемых изолятов (G1, G9, G10, G17, G20), основанное на гомологии фрагмента гена 16S рРНК с имеющимися в базе данных организмами Повышение общего урожая растений, % ь л S S G G о G G G G G G р т н о к Известны примеры биоремедиации органических згрязнений в почве при интродукции PGPR из родов Pseudomonas и Enterobacter, при этом они играли роль в повышении устойчивости растений и увеличении роста последних при углеводородном загрязнении почвы (Huang et al., 2005) и в присутствии полиароматических углеводородов (Huang et al., 2004).

Рис. 14 Филогенетическое дерево на основе последовательности гена 16S рРНК, включающее последовательности 14 азотфиксирующих микроорганизмов, выбранных из базы данных как представителей различных систематических групп, и экспериментально полученные последовательности гена 16S рРНК диазотрофных изолятов шлама (в рамке).

Экспериментальные последовательности внесены в базу данных Gene Bank, их номера приведены после обозначения изолята.

Несмотря на широкие метаболические способности азотфиксаторы, выделенные из шламов представлены достаточно узкой группой близкородственных организмов, относящихся -Proteobacteria, на филогенетическом дереве, отражающем многообразие азотфиксирующих микроорганизмов (Рис. 14).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Впервые выявленные нами в промышленных углеводородных шламах азотфиксирующие микроорганизмы, оценка их таксономической принадлежности и физиолого-биохимических свойств, позволяют рассматривать данные отходы как уникальную экологическую нишу для сохранения узкого круга диазотрофных микроорганизмов, которые, как оказалось, играют важную роль в процессе фиторемедиации шлама путем снабжения биоценоза доступным азотом, участия в деградации загрязнений и поддержания роста растений в экстремальных условиях углеводородного отхода. Полученные результаты следует рассматривать с позиций новой концепции диазотрофии в антропогенной экосистеме, ключевые параметры которой принципиально отличаются от таковых природных экосистем и агроэкосистем. Выявленные закономерности выживания диазотрофов, их видового разнообразия, взаимодействия с растениями-фитомелиорантами положены в основу новой технологии фиторемедиации углеводородных шламов, частью которой является данная работа.

ВЫВОДЫ 1. В твердых отходах (шламах) нефтепереработки, нефтехимии и органического синтеза впервые обнаружены генетические детерминанты процесса азотфиксации (фрагменты nifH гена), а также жизнеспособные азотфиксирующие микроорганизмы на уровне 105-106 КОЕ/г, активность которых не превышала 0,5 мг N2/кг шлама*ч;

2. В сообществе аэробных гетеротрофных микроорганизмов химического шлама до 85% представителей содержат в своем геноме nifH ген, при этом до 95% этих микроорганизмов представлены родом Stenotrophomonas;

3. При добавлении к химическому шламу почвы и выращивании устойчивых растений в отсутствие удобрений уровень азотфиксирующей активности возрастает пятикратно, при этом темпы разложения углеводородного загрязнения сопоставимы с аналогичным вариантом, включающим применение азотных удобрений;

4. Создана коллекция азотфиксирующих изолятов, выделенных из шламов, сочетающих способность к утилизации компонентов шлама (многоатомные спирты, алканы, ПАУ) с рост-стимулирующим потенциалом в отношении растений (растворение труднодоступных соединений фосфора, синтез фитогормонов (индолилуксусная кислота), антагонистическая активность против бактериальных и грибных фитопатогенов);

5. При бактеризации семян азотфиксаторами, выделенными из углеводородных шламов, на 90% снижается количество зараженных семян фитопатогенными микромицетами, и до 2,5 раз увеличивается биомасса растений при выращивании их в условиях химического шлама;

6. На основании анализа нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК установлено, что наиболее перспективные с точки зрения фиторемедиации штаммы азотфиксаторов относятся к родам Pseudomonas и Enterobacter, входящим в группу -протеобактерий.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Наумова Р.П. Предобработка твердого химического отхода перед его биоремедиацией [Текст] / Р.П. Наумова, В.Н. Кудряшов, А.А. Несмелов, Р.Р. Гафуров, И.Р. Мухаметшин, Р.Р. Баширов, Т.В. Григорьева // Защита окружающей среды в нефтегазовом комплексе.- 2008.- №4.- С. 29-31.

2. Наумова Р.П. Предварительная оценка потенциала фиторемедиации твердых химических отходов [Текст] / Р.П. Наумова, В.Н. Кудряшов, Т.В. Григорьева, Р.Р. Гафуров, И.Р. Мухаметшин, Р.Х. Хузаянов, А.А.

Несмелов // Ученые записки Казанского государственного университета.

Естественные науки.- 2008.- Т. 150.- кн. 2.- С. 155-166.

3. Naumova R.P. Diazotrophs originated from petrochemical sludge as a potential resource for waste remediation [Text] / R.P. Namova, T.V. Grigoreva, A.A. Rizvanov, V.Y. Gorshkov, N.V. Kudrjashova, A.V. Laikov // World Applied Science Journal.- 2009.- V.6, N. 2.- P. 154-157.

4. Якушева О.И. Новый подход к обезвреживанию нефтешлама с целью последующей фиторемедиации [Текст] / О.И. Якушева, Т.В. Григорьева, Р.А. Галиев, А.А. Несмелов, Р.З. Юсупов, Р.П. Наумова; Казан. гос. ун-т.- Казань, 2006.- 16 с.- Деп. в ВИНИТИ 11.01.2007, № 17-B2007.

5. Галиев Р.А. Токсикорезистентные растения для ремедиации твердых отходов (шламов) нефтехимического производства [Текст] / Р.А. Галиев, О.И. Якушева, Т.В. Григорьева, А.Р. Якупов, Д.К. Мустафин // 9-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века»: Сб. тезисов.- Пущино, 2005.- С. 341.

6. Григорьева Т.В., Биотехнологическое обезвреживание опасных твёрдых отходов нефтехимии [Текст] / Т.В. Григорьева, Р.А. Галиев, Р.П.

Наумова // Всероссийская выставка научно-технического творчества молодёжи: Сб. материалов.- Москва, 2005.- С.204-205.

7. Григорьева Т.В. Оценка потенциала ремедиации нефтешлама при варьировании дозы минеральных удобрений и почвы [Текст] / Т.В.

Григорьева, Г.А. Ситдикова, Р.П. Наумова // 10-я Пущинская школаконференция молодых ученых «Биология - наука XXI века»: Сб. тезисов.- Пущино, 2006.- С. 365.

8. Григорьева Т.В. Оценка потенциала биоремедиации твердых отходов нефтехимии [Текст] / Т.В. Григорьева, Р.А. Галиев, А.А. Несмелов, Р.З.

Юсупов, О.И. Якушева, Р.П. Наумова // Российская школа-конференция молодых ученых «Экотоксикология: современные биоаналитические системы, методы и технологии»: Сб. статей.- Пущино-Тула, 2006.- С. 90.

9. Григорьева Т.В. Отбор свободноживущих диазотрофов для защиты растений [Текст] / Т.В. Григорьева, Е.Г. Иванова // Всероссийская научнопрактическая конференция с международным участием «Проблемы региональной экологии в условиях устойчивого развития»: Сб. материалов.- Киров, 2007.- С. 187-189.

10. Григорьева Т.В. Азотфиксирующие аборигены химических шламов – перспективный ресурс экологической биотехнологии [Текст] / Т.В.

Григорьева, А.А. Ризванов, Ю.В. Гоголев, А.В. Лайков, Р.П. Наумова // 12-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века»: Сб. тезисов.- Пущино, 2008.- С. 260.

11. Grigoryeva T.V. Nitrogen fixing bacteria inhabiting hazardous industrial wastes [Text] / T.V. Grigoryeva, A.A. Rizvanov, Y.V. Gogolev, A.V. Laikov, R.P.

Naumova // Proceedings of the First interuniversity conference on modern biology «Bio-news».- Kazan, 2008.- P. 25.

12. Naumova R.P. Development of biotechnologies for industrial toxic wastes remediation [Text] / R.P. Naumova, O.I. Yakusheva, T.V. Grigoryeva, A.A.

Pages:     | 1 | 2 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»