WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Численность и разнообразие свободноживущих азотфиксирующих микроорганизмов, населяющих углеводородные шламы, оценивали по количеству колоний на селективной безазотистой среде Эшби (Теппер с соавт., 2004), а также путем учета разнообразия и количества микроорганизмов, содержащих в геноме nifH ген, в сообществе аэробных гетеротрофов (выделенных из шламов на мясо-пептонном агаре (МПА)).

Выделение тотальной ДНК шлама проводили с использованием стандартного набора FastDNA SPIN Kit for Soil (Bio 101, США).

Для амплификации nifH гена использовали метод nested ПЦР, предложенный Widmer et al. (1999).

Филогенетический анализ отобранных диазотрофных изолятов проводили на основании нуклеотидных последовательностей фрагментов гена 16S рРНК, амплифицированных с использованием стандартных праймеров 16-18s U1F-U1R и просеквенированных на секвенаторе ABI Prism 310 Genetic Analyzer (USA). Поиск гомологичных последовательностей проводили с помощью программного пакета BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей проводили с помощью программы ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html). Филогенетические деревья построены программой Phylip методом максимальной экономии.

Визуализация филогенетических деревьев проведена с помощью программы TreeView (http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html). Полученные последовательности гена 16S рРНК выделенных из шлама изолятов внесены в базу данных GeneBank (http://ncbi.hlm.nih.gov/Bankit/nph-bankit.cgi).

Азотфиксирующую активность образцов шлама и выделенных изолятов определяли с помощью газовой хроматографии, ацетиленовым методом (Гарусов с соавт., 1999).

Скрининг перспективных для фиторемедиации диазотрофных микроорганизмов был основан на оценке их азотфиксирующей активности, способности утилизировать компоненты шлама, повышать растворимость труднодоступных соединений фосфора, продуцировать фитогормон (индолилуксусную кислоту) и проявлять антагонистическую активность по отношению к фитопатогенам. Скрининг проводили среди изолятов, выделенных на твёрдой среде Эшби при посеве образцов ризосферы устойчивых растений при росте последних в подготовленном шламе.

Способность изолятов утилизировать компоненты шлама оценивали качественно, по росту на модифицированных средах Эшби с использованием гексадекана, полиэтиленгликоля, нафталина и непосредственно шлама в качестве источников углерода и энергии.

Продукцию индолилуксусной кислоты (ИУК) изолятами оценивали фотоколориметрически, с использованием реагента Сальковского на среде, содержащей в качестве предшественника ИУК L-триптофан (Husen, 2003).

Способность изолятов к солюбилизации фосфатов оценивали по просветлению зон вокруг колоний при росте на твёрдой среде, содержащей нерастворимую соль фосфорной кислоты (Beneduzi et al., 2008).

Антагонистическую активность диазотрофных изолятов в отношении фитопатогенных микромицетов (Aspergillus niger, Aspergillus sp, Fusarium sp., Alternaria sp.) и бактерий (Pseudomonas syringae, Ervinia caratovora (SCRI), Xantomonas solunocerum (9049)) оценивали по подавлению роста патогенов при совместном культивировании на картофельноглюкозном агаре (КГА). Бактериальные фитопатогены были взяты из коллекции Казанского института биофизики и биохимии РАН, грибные патогены выделены из посевного материала растений (овес Avena sativa L.), используемых для фиторемедиации шлама.

Эффекты интродукции отобранных в ходе скрининга диазотрофных изолятов оценивали в лабораторном эксперименте при выращивании гороха (Pisum sativum) и овса (Avena sativa L.) в подготовленном химическом шламе КОС. Семена растений обрабатывали разбавленной суточной культуральной жидкостью изолятов, выросших на мясо-пептонном бульоне, с титром кл/мл. Эффекты бактеризации оценивали по снижению уровня зараженности семян грибными фитопатогенами (методом анализа семян на питательных средах по ГОСТ 12044-93) и увеличению накопления биомассы растений при их выращивании в подготовленном химическом шламе КОС.

Моделирование фиторемедиации химического шлама проводили в 6-и месячном лабораторном эксперименте. Оценивали динамику азотфиксирующей активности, урожай растения-мелиоранта и уровень остаточного загрязнения в следующих вариантах опыта: шл; шл+поч; шл+уд;

шл+поч+уд; шл+поч+раст; шл+поч+уд+раст, где шл – химический шлам КОС, специально подготовленный к фиторемедиации; поч – почва (20% от объема шлама); уд - NH4NO3 (0,35 гN/кг сухого веса шлама); раст – растениефитомелиорант (плевел Lollium perenne L.) (90 г/м2).

Содержание хлороформ-экстрагируемых веществ определяли гравиметрически после экстракции образца хлороформом в аппарате Сокслета (Versan et al., 1998).

Общее содержание органического углерода и азота определяли по классическим методикам Тюрина и Къельдаля, соответственно (Аринушкина, 1970). Валовое содержание фосфора определяли фотоколориметрически по образованию фосфорно-молибденового комплекса в соответствии с ГОСТ 26207 (1992) pH образцов определяли с помощью иономера в водном экстракте, приготовленном в соотношении образец:вода 1:5.

Плотность образцов оценивали согласно ISO 11272:1998.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Выявление азотфиксирующих микроорганизмов в промышленных углеводородных шламах Выделение тотальной ДНК из проб шламов и амплификация маркерного гена азотфиксации (nifH) с этой матрицы (рисунок 1А, Б) впервые позволили установить наличие в исследуемых отходах микроорганизмов, потенциально способных к фиксации атмосферного азота.

Рис. 1 Выявление nifH гена в составе тотальной ДНК, выделенной из образцов шламов и почвы. А – тотальная ДНК; Б – амплификация nifH гена с тотальной ДНК. 1 –нефтехимический шлам (НКНХ); 2 – химический шлам (КОС); 3 – шлам нефтепереработки (УНПЗ); 4 – почва; 5 – ДНК маркер (1кб) На безазотистой твердой среде Эшби (рис 2А) выявлено высокое содержание свободноживущих диазотрофных бактерий во всех исследуемых шламах (на уровне 105-106 КОЕ/г) по сравнению с черноземной почвой (КОЕ/г). Однако, азотфиксирующая активность исследуемых образцов шламов (0,2-0,4 мг N2/кг*ч) оказалась существенно ниже, чем в почве (0,7 мг N2/кг*ч) (рис. 2Б).

6,5,5,5,5,4,4,4,4,0,0,0,0,0,0,0,0,0,нефтехимический химический шлам шлам почва шлам НКНХ КОС нефтепеработки УНПЗ Рис.2 Численность диазотрофных организмов (А) и азотфиксирующая активность (Б) в различных шламах по сравнению с почвой Таким образом, сопоставление численности диазотрофов и нитрогеназной активности шламов, извлеченных из шламонакопителя, свидетельствует о выживании в шламах азотфиксирующей микрофлоры, потенциал которой не реализуется в полной мере. Это может быть связано как с токсическими, так и с неблагоприятными физическими свойствами углеводородных отходов, обуславливающими гипометаболическое состояние микрофлоры (Nikitina et al., 2003; Наумова с соавт., 2008).

Азотфиксирующая активность, мг N/кг * ч Численность диазотрофов, log КОЕ/г Диазотрофные бактерии химического шлама КОС Для характеристики сообщества истинных азотфиксирующих микроорганизмов использовали сочетание классических микробиологических методов с методами молекулярной биологии.

Принадлежность к группе азотфиксирующих микроорганизмов оценивали по наличию nifH гена в геноме изолятов, выделенных из нативного химического шлама КОС на богатой среде (МПА).

Численность аэробных гетеротрофных микроорганизмов, выделенных на МПА, в шламе оказалась относительно невысокой – до 107 КОЕ/г (табл. 1).

Оказалось, что для шлама характерно относительно низкое микробное разнообразие (нам удалось выявить только 12 различных морфотипов колоний) и доминирование двух представителей в сообществе (до 85%) (рис.

3).

Удивительным оказалось высокое содержание (до 95%) потенциальных азотфиксаторов, содержащих в составе геномной ДНК nifH ген, в сообществе аэробных гетеротрофов химического шлама КОС (рис. 3). Вероятно, на стадии изначального формирования шлама как твердой фракции сточных вод, перегруженной углеродом и характеризующейся недостатком доступного азота, диазотрофные микроорганизмы получают селективное преимущество и накапливаются в сообществе.

Рис. 3 Структура сообщества аэробных гетеротрофных микроорганизмов химического шлама КОС и распределение способности к азотфиксации (наличие в геноме изолятов nifH гена) среди его представителей Филогенетический анализ двух доминирующих представителей исследуемого нами сообщества, проведенный на основании последовательности гена малой субъединицы рРНК, позволил отнести их к Proteobacteria, роду Stenotrophomonas. Бактерии рода Stenotrophomonas являются близкородственными по отношению к роду Pseudomonas. Помимо недавно установленной способности некоторых представителей рода Stenotrophomonas к азотфиксации (Reinhard et al., 2008), они представляют биотехнологический интерес в связи с защитой растений от фитопатогенов (Wolf et al., 2002) и биоремедиацией загрязненных почв (Binks et al., 1995).

Азотфиксация в ходе моделирования фиторемедиации шлама Исходный шлам, извлеченный из накопителя, в связи с его специфическими физическими и химическими свойствами, проявляет 100% фитотоксичность, поэтому технология фиторемедиации не применима непосредственно для таких шламов (Наумова с соавт., 2008a). В связи с этим, А.А. Несмеловым была осуществлена подготовка химического шлама КОС по оригинальному методу (Наумова с соавт., 2009), в условиях которой происходит значительное снижение уровня загрязнений и токсичности, а также оптимизация структуры шлама до уровня, совместимого с ростом растений. В лабораторном эксперименте с подготовленным химическим шламом мы моделировали основные агротехнические приемы, применяемые в технологии фиторемедиации. Удалось выявить некоторые факторы, влияющие на уровень азотфиксирующей активности шлама и оценить ее потенциал и вклад в поддержание роста растений и деградацию углеводородного загрязнения.

Выраженный стимулирующий эффект на активность азотфиксирующей микрофлоры оказывает участие растения-фитомелиоранта и улучшение структуры шлама, связанное с внесением почвы в качестве наполнителя (рис.

4). При этом величина азотфиксирующей активности в вариантах с растениями увеличивалась восьмикратно и достигала уровня более 3 мг N2/кг*ч, что превышает потенциал азотфиксации в сельскохозяйственных почвах (Шурхно с соавт., 2004).

3,2,1,0,0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22.

Время, нед шл шл+почва - посев шл+уд шл+почва+уд растений шл+поч+раст шл+поч+уд+раст Рис.4 Динамика азотфиксирующей активности в ходе моделирования фиторемедиации химического шлама КОС * Азотфиксирующая активность, мг N /кг ч 0 0 10 20 30 40 сутки 1 посев 2 посев шл+почв+раст шл+почв+уд+раст шл+почв+раст шл+почв+уд+раст Рис. 5 Характеристика роста растения-мелиоранта (плевел Lollium perenne L.) (А) и общего урожая растений в ходе моделирования фиторемедиации химического шлама КОС Минеральные азотные удобрения (в виде NH4NO3 1,3 г/кг - половинная доза азота от его необходимого количества для микробной биодеградации загрязнений и корректировки соотношения C:N в шламе до 30:1) ингибировали как азотфиксирующую активность, так и рост растениямелиоранта (рис. 5А). Общий урожай биомассы растений после первого и второго посевов в варианте с удобрениями был ниже на 30 и 20%, соответственно, по сравнению с вариантом без внесения азота (рис. 5Б).

Таким образом, даже сниженное количество удобрений сопоставимое с рекомендуемым для почв, приводит к угнетению роста растений на фоне токсичности самого шлама.

Рис. 6 Убыль углеводородного загрязнения химического шлама КОС в вариантах эксперимента по моделированию фиторемедиации Сопоставление остаточного уровня загрязнений в вариантах с удобрениями и без них позволило оценить вклад сообщества аборигенных азотфиксаторов в обеспечение растения-фитомелиоранта и микроорганизмов-деструкторов доступным азотом. В варианте с растениями без внесения дополнительного азота (шл+поч+раст), в котором выявили наивысшую азотфиксирующую активность, темпы разложения биомассы Высота зеленых побегов, см Общий урожай растений, г сухой Убыль хлороформизвлекаемых веществ, % углеводородного загрязнения практически сопоставимы с аналогичным вариантом на фоне азотных удобрений (шл+поч+уд+раст) (рис. 6). Таким образом, мы впервые продемонстрировали возможность замены коммерческих удобрений биологическим процессом фиксации азота.

Скрининг перспективных для фиторемедиации диазотрофных микроорганизмов В связи с тем, что в технологии фиторемедиации интенсивность всех биологических процессов, в том числе и биодеградации загрязнений, во многом зависит от состояния растения-мелиоранта, в последнее время широко исследуют возможности ризобактерий, способных увеличивать рост растений (PGPR) на фоне различных загрязнений. Применительно к шламам в литературе такие данные отсутствуют, но на примере углеводородзагрязненных почв показано положительное влияние таких бактерий на рост растений и темпы фиторемедиации в целом (Hutchinson et al., 2001; Huang et al., 2007).

С целью выявления наиболее биотехнологически перспективных азотфиксаторов для фиторемедиации шлама провели первоначальный скрининг по величине нитрогеназной активности среди изолятов, выделенных нами из различных углеводородных шламов, и отобрали десять наиболее активных (Табл. 1). Дальнейший скрининг среди десяти отобранных изолятов включал оценку их способности к утилизации компонентов шлама и рост-стимулирующих свойств в отношении растенийфитомелиорантов.

Таблица Характеристика азотфиксирующих изолятов, выделенных из шламов Изолят Источник выделения Нитрогеназная активность, нмоль С2Н4/мл*ч G1 Ризосфера рогоза в шламе НКНХ 14,2±0,G9 Ризосфера плевела в шламе КОС 8,5±0,G10 Ризосфера плевела в шламе КОС 13,6±0,G11 Предобработанный шлам КОС 5,8±0,G12 Исходный шлам НКНХ 5,1±0,G17 Предобработанный шлам НКНХ 13,2±0,G20 Предобработанный шлам НКНХ 11,4±0,G22 Исходный шлам УНПЗ 4,9±0,S1 Исходный шлам КОС 4,0±0,S2 Исходный шлам КОС 4,3±0, Все десять исследуемых изолятов являлись истинными азотфиксаторами, с активностью восстановления азота на уровне 4-15 нмоль С2Н4/мл*ч (Табл. 1) сопоставимой с таковой известных свободноживущих азотфиксаторов из рода Azotobacter (Ravikumar et al., 2004). Более того, установили наличие в их геноме генов азотфиксации (nifH) (рис. 7).

Рис. 7 ПЦР амплификация фрагмента nifH гена с геномной ДНК коллекционных изолятов.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»