WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 ||

Межвидовая антагонистическая активность бактерий рода Lactobacillus Штаммы с сильной Штаммы со средней Штаммы со слабой антагонистической антагонистической антагонистической активностью активностью активностью L. plantarum 30 L. plantarum 8 RA-3 L. casei L. delbrueckii 76 L. fermentum L. rhamnosus 1790 L. fermentum 90 ТС-L. acidophilus АЩГL. casei L. acidophilus Рис. 4. Схема, демонстрирующая разделение штаммов лактобацилл по степени антагонистической активности Данные о межвидовых взаимоотношениях, полученные нами, позволили выделить группу бактерий рода Lactobacillus, наиболее перспективных в отношении совместного культивирования. Наибольший интерес из этой группы лактобактерий представляют штаммы L. plantarum 8 RA-3 и L. fermentum 39, так как обладают выраженным антагонизмом по отношению к условнопатогенным микроорганизмам и устойчивостью к спектру антибактериальных средств, недетерминированной плазмидами [Соколова К.Я. и др., 2004]. В нашем исследовании установлена высокая степень биосовместимости этих штаммов, что определило целесообразность их использования в составе стартерной культуры для совместного культивирования. Указанные штаммы имеют сходный оптимум рН и температуры культивирования (370С), общие источники углеводного и белкового питания, устойчивы к действию бактериоцинов друг друга и собственных. На следующем этапе работы проведено изучение динамики роста двух штаммов бактерий рода Lactobacillus:

L. plantarum 8 RA-3 и L. fermentum 39 в условиях раздельного и совместного культивирования с использованием двух методических подходов. С целью контроля титра каждого штамма в смешанной популяции и при раздельном способе культивирования была применена вновь разработанная методика индикации и идентификации бактерий рода Lactobacillus на основе ПЦР.

Реакцию проводили в 2 стадии: родоспецифичная ПЦР с использованием праймеров FLg и RLgI и видоспецифичная ПЦР с использованием праймеров FERM 1, PLANT 1 и RLgII. Кроме этого, нами была использована дифференциально-диагностическая среда МДС-м, позволяющая проводить дифференциацию и подсчет колоний лактобацилл L. plantarum 8 RA-3 и L.

fermentum 39 в смешанной популяции. Для контроля данных метода ПЦР и среды МДС-м применяли титрование проб путем десятичных разведений на жидкой среде МДС-2.

Высевы на среды МДС-м и МДС, и отбор проб для ПЦР проводили в отдельных контрольных точках - 3 ч, 6 ч, 9 ч, 12 ч, 24 ч, 27 ч культивирования.

Выбор контрольных точек основывался на опыте предыдущих исследований и позволял проследить длительность и характер всех фаз роста микробной популяции.

В первой контрольной точке (через 3 часа инкубации) количество микроорганизмов в 1 мл среды составляло 1х104 КОЕ/мл во всех трех вариантах (I- монокультура L. plantarum 8 RA-3; II – монокультура L. fermentum 39; III- смешанная культура L. plantarum 8 RA-3 + L. fermentum 39). Далее по ходу опыта не отмечено существенных различий в динамике роста всех трех вариантов культивирования. Через 6 часов роста количество КОЕ/мл во всех вариантах составило 1х107, через 9 часов – 1х108, через 12 часов – 1х1010. В точках, соответствующих 24 и 27 часам культивирования плотность микробной популяции снижалась и составляла 1х109 КОЕ/мл. Длительность лаг-фазы во всех вариантах составляла 3 часа (с 3 по 6 час культивирования), длительность экспоненциальной фазы роста – 6 часов (с 6 по 12 час), затем наблюдался выход на плато – стационарная фаза роста (рис.5,А).

Для всех трех вариантов была определена удельная скорость роста (µ) в течение лаг- и лог фазы. Установлена близкая удельная скорость роста популяции в условиях совместного и раздельного культивирования (p<0.05).

3 6 9 12 24 время, ч 3 6 9 12 24 время, ч L. fermentrum в монокультуре А Б L. platarum + a fermentum L. fermentum в монокультуре L. plantarum + L. fermentum 3 6 9 12 24 3 6 9 12 24 время, ч L. plantarum в монокультуре время, ч L. plantarum + L. fermentum L. plantarum в монокультуре L. plantarum + L. fermentum Рис. 5. Развитие микробной популяции L. plantarum 8 RA-3 и L. fermentum при совместном и раздельном культивировании по данным классической микробиологии (высев на среду МДС-м)(А) и по данным ПЦР (Б).

Использование ПЦР позволило определить «конечные точки» (последнее разведение микробной культуры, в котором при постановке ПЦР присутствует ампликон) для каждого контрольного часа культивирования (рис.5, Б). Таким lg KOE/мл lg КОЕ/мл Значение "конечной точки" lg KOE/мл Значение "конечной точки" lg КОЕ/мл образом была прослежена динамика роста штаммов L. plantarum 8 RA-3 и L.

fermentum 39 при совместном культивировании. С использованием этих данных были определены рекомендуемые контрольные разведения. Наличие ампликонов в этих разведениях при проведении ПЦР служит показателем количества искомого штамма в культуре.

Параллельное использование двух методических подходов – молекулярно-биологической методики на основе ПЦР и классического посева с использованием среды МДС-м позволило точно установить картину динамики роста штаммов-продуцентов в процессе совместного культивирования, характеризовать их взаимодействия как синергидные и доказать целесообразность создания пробиотического препарата на их основе с применением принципа совместного культивирования.

Поставленный опыт позволил определить контрольные разведения, т.е.

десятикратные разведения бактериальных культур из которых целесообразно производить высевы на питательные среды и отбирать культуры для постановки родоспецифичной ПЦР в соответствующих периодах культивирования.

Суммируя все вышесказанное, можно заключить, что в рамках представленной работы с использованием штаммов лактобактерий с охарактеризованными биохимическими свойствами создана методика индикации бактерий рода Lactobacillus на основе ПЦР гена 16S рРНК; подобран наиболее эффективный метод выделения ДНК лактобацилл; установлены нуклеотидные последовательности фрагмента гена 16S рРНК пробиотических штаммов лактобацилл L. fermentum 39, L. plantarum 8RA-3 и L. casei 583;

предложена унифицированная комплексная схема видовой идентификации 6-ти промышленно-значимых видов рода Lactobacillus: L. fermentum, L. plantarum, L. acidophilus, L. rhamnosus, L. casei, L. delbrueckii с использованием гнездовой ПЦР; вновь созданная методика эффективно апробирована с использованием референтных штаммов лактобацилл, показана достоверная сопоставимость методики идентификации на основе ПЦР и классического биохимического метода; получены новые данные о межвидовых взаимоотношениях промышленно-значимых лактобацилл; выделена группа биосовместимых видов, перспективных в отношении совместного культивирования; обоснована возможность применения методики в полуколичественном варианте для контроля видового состава и титра штаммов-продуцентов пробиотических препаратов.

ВЫВОДЫ 1. На основе изучения биохимических свойств 11-ти вновь выделенных штаммов лактобацилл определена их видовая принадлежность (2 штамма отнесены к виду Lactobacillus acidophilus, 1 штамм – к виду L. delbrueckii, 2 штамма идентифицированы как L. casei, 1 штамм как L. paracasei, штамма как L.plantarum, 3 штамма как L. rhamnosus).

2. Подобрана новая композиция универсальных олигонуклеотидных праймеров для специфической амплификации фрагмента гена 16S рРНК бактерий рода Lactobacillus различных биохимических групп.

3. Впервые установлена нуклеотидная последовательность участка гена 16S рРНК штаммов лактобацилл L. plantarum 8 RA-3, L. casei 583, L.

fermentum 39.

4. Показана высокая эффективность выделения ДНК лактобацилл из различных субстратов методом нуклеосорбции.

5. Разработана унифицированная схема видовой идентификации бактерий рода Lactobacillus с использованием гнездового варианта ПЦР.

6. Впервые установлена биосовместимость штаммов L. plantarum 8 RA-3 и L. fermentum 39 и показана близкая удельная скорость роста популяции в условиях совместного и раздельного культивирования (p<0.05).

7. Показана возможность применения метода на основе ПЦР с использованием «конечных точек» для контроля динамики роста L.

plantarum 8 RA-3 и L. fermentum 39 в условиях совместного культивирования.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ I. Работы, опубликованные в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, определенных ВАК:

1. Точилина А.Г. Новые молекулярно-биологические технологии для идентификации пробиотических микроорганизмов/ Точилина А.Г., Соловьева И.В., Новикова Н.А., Соколова К.Я., Белова И.В., Иванова Т.П. // Доклады Всероссийской научно-технической конференции «Приоритетные направления развития науки и технологий». – Тула, 2007. – С. 52-54.

2. Точилина А.Г. Индикация и идентификация бактерий рода Lactobacillus с использованием полимеразной цепной реакции/ Точилина А.Г., Новикова Н.А., Соколова К.Я., Соловьева И.В., Белова И.В., Иванова Т.П.// Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2008, №3. – С. 69-73.

II. Статьи, доклады, тезисы докладов региональных и всероссийских конференций:

1. Новикова Н.А. Разработка метода индикации лакто- и бифидобактерий на основе мультиплексной полимеразной цепной реакции / Новикова Н.А., Мочалова А.Г., Соколова К.Я., Соловьева И.В., Голицына Л.Н., Новиков Д.В.

// Материалы международной конференции «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы». – М., 2004. – С.59-60.

2. Точилина А.Г. Перспективы применения ПЦР для индикации промышленно- значимых штаммов молочнокислых бактерий / Точилина А.Г., Новикова Н.А., Соколова К.Я., Соловьева И.В.// Материалы научной конференции, посвященной 85-летию со дня рождения Блохиной «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний». – Н.Новгород: Изд-во ННГУ им. Н.И.

Лобачевского, 2006. – с. 241-245.

3. Точилина А.Г. Разработка экспресс-метода для видового контроля штаммов-продуцентов многокомпонентных пробиотиков / Точилина А.Г., Новикова Н.А., Соловьева И.В., Соколова К.Я., Белова И.В., Иванова Т.П. // Материалы 4-го съезда общества биотехнологов России им. Ю.А.Овчинникова, г. Пущино. – 2006. – С.263-264.

4. Точилина А.Г. Совершенствование методов микробиологического контроля БАД к пище / Точилина А.Г., Новикова Н.А., Соколова К.Я. // Журнал «Клиническое питание». Материалы Международного конгресса по пробиотикам. – 2007. – №1-2.

5. Соловьева И.В. Новые биотехнологические аспекты конструирования жидких форм симбиотиков / Соловьева И.В., Соколова К.Я, Григорьева Г.И., Точилина А.Г., Белова И.В., Иванова Т.П.// Доклады Всероссийской научнотехнической конференции «Приоритетные направления развития науки и технологий». – Тула, 2007. – С. 50-52.

Pages:     | 1 | 2 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»