WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

plantarum 30, L. delbrueckii 76, L. rhamnosus 1790, L.acidophilus 1660, L. casei 583, L. plantarum 1862, L. paracasei spp. paracasei 6, L. rhamnosus 7, L. rhamnosus 526. Необходимо отметить, что первичное установление способности ферментировать сахара, многоатомные спирты и гидролизовать глюкозиды и видовая идентификация этих микроорганизмов была проведена в 1990 году при их выделении с использованием доступных и актуальных на тот момент тестсистем и питательных основ. Нашей задачей является расширенное изучение биохимических свойств этих штаммов с использованием коммерческих стандартизированных тест-систем фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited», Индия.

Изученные микроорганизмы относятся к двум разным биохимическим группам: виды L. delbrueckii, L. acidophilus относятся к группе гомоферментативных лактобацилл, а виды L. casei, L. plantarum, L. paracasei, L. rhamnosus – к группе факультативно-гетероферментативных лактобацилл.

Метаболизм сахаров у представителей этих групп принципиально отличается: в первом случае генетически детерминирован гликолитический путь, во втором – пентозофосфатный. Гомоферментативные лактобациллы неспособны сбраживать пентозы, что подтверждено нашими исследованиями (табл. 1).

В результате работы нами был изучен спектр утилизируемых субстратов:

углеводов, в том числе олигосахарид раффиноза, метаболизм которого вновь выделенными штаммами не был изучен ранее, многоатомных спиртов (сорбит, маннит) и глюкозидов (салицин, эскулин). Из таблицы 1 видно, что наибольшее количество субстратов утилизируют лактобациллы, принадлежащие к группе факультативно-гетероферментативных лактобацилл. Это связано с тем, что гомоферментативные лактобациллы неспособны сбраживать пентозы, а гетероферментативные микроорганизмы обладают двумя путями метаболизма сахаров, при этом сбраживание гексоз происходит по гликолитическому пути, а пентоз – по пентозофосфатному.

Таблица Биохимические свойства вновь выделенных штаммов лактобацилл Виды Гомоферментативные лактобациллы L. acidophilus АЩГ3 + + + + - + - + + + + - - - + - L. acidophilus 1660 + + + + - + - + + + - - - - + - L. delbrueckii 76 + - + - - - - - - - - - - - - - ssp. bulgaricus Факультативно-гетероферментативные лактобациллы L. casei 583 + + + + + + - - + + + - + - + + L. casei 577 + + + + + + - - + + + - + - + + L. paracasei 6 + + + + + + - - + + + - + - + + ssp. paracasei L.plantarum 30 + + + + + + + + + + + - + - + + L.plantarum 1862 + + + + + + + + + + + + + - + + L. rhamnosus 1790 + + + + + + - - + + + - + - + + L. rhamnosus 526 + + + + + + - - + + + - + - + + L. rhamnosus 7 + + + + + + - - + + + - + - + + Номер штамма Целлобиоза Галактоза Лактоза Мальтоза Маннит Манноза Мелибиоза Раффиноза Салицин Сахароза Трегалоза Арабиноза Сорбит Ксилоза Эскулин Мелецитоз аа Практический и научный интерес представляет изучение способности лактобацилл к утилизации раффинозы. Этот углевод относится к группе фосфоолигосахаридов (ФОС), используется в составе пробиотических препаратов в качестве пребиотического компонента. Способность к утилизации этого олигосахарида зависит от наличия или отсутствия специфических гликозил-гидролаз. Раффинозу утилизировали штаммы, относящиеся к виду L. plantarum и L.acidophilus, у видов L. casei, L. paracasei, L. delbrueckii утилизации этого олигосахарида не наблюдалось.

При проведении видовой идентификации по спектру изученных свойств возникли трудности при дифференциации видов L. casei, L. paracasei spp.

paracasei и L. rhamnosus, так как их биохимические свойства сходны, отличием является лишь способность к росту при 15С и 450С. Подобные сложности при использовании биохимического метода обуславливают актуальность разработки альтернативных методов идентификации на основе молекулярногенетических характеристик.

2. Разработка методики индикации бактерий рода Lactobacillus на основе специфической амплификации нуклеиновых кислот Индикация и идентификация молочнокислых бактерий классическими биохимическими методами затруднена, так как предусматривает выделение чистой культуры и, соответственно, занимает достаточно длительный отрезок времени (до 8 суток), в связи с чем неудобна для практических лабораторий и, тем более, не удовлетворяет требованиям текущего оперативного контроля продуктов питания. В связи с вышеизложенным очевидно, что разработка унифицированной схемы индикации и идентификации бактерий молочнокислого брожения, в частности широко применяемых в микробиологической промышленности микроорганизмов рода Lactobacillus, представляется актуальной задачей, имеющей большое научно-практическое значение.

На первом этапе работы с использованием программы Mega v.3.0 и Mega v.4.0 нами был проведен сравнительный анализ 43 выровненных полных нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК бактерий молочнокислого брожения. Пример анализа показан в таблице 2.

По результатам анализа сконструированы новые универсальные праймеры для индикации бактерий рода Lactobacillus также на основе гена 16S рРНК: FLg, RLg I, RLg II.

Пара праймеров FLg - RLg I фланкирует фрагмент гена 16S рРНК, расположенный с 48 по 785 нуклеотид, размер получаемого фрагмента – п.н. Размер фрагмента, получаемого при работе с парой праймеров FLg - RLg II составляет 612 п.н. Эта пара праймеров фланкирует фрагмент гена 16S рРНК, расположенный с 48 по 660 нуклеотид. Позиции указаны по последовательности гена 16S рРНК L. casei BCRC10697.

Таблица Нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК бактерий молочнокислого брожения в регионе прямого родового праймера FLg Источник Нуклеотидные последовательности (5, 3,) FLg аtg caa gtc gag cga gyt L. delbrueckii JSQ2 --- --- --- --- --- --- Bifidobacterium sp. --- --- --- --a --g tga Leuconostoc sp. --- --- --- --a --c -ca Lactococcus sp. t-a gg- ag- -cc -tc c-- Streptococcus sp. --- --- --a --a --c tga Carnobacterium sp. --- --- --- --a --c t-- Propionibacterium sp. c-- --- agt cg- aac cgg Теоретическая специфичность праймеров была подтверждена экспериментально на 12 штаммах бактерий, из них 9 штаммов рода Lactobacillus, 2 штамма рода Bifidobacterium и 1 штамм рода Streptococcus.

(рис.1) 1 1 2 3 4 1 2 3 4 5 М 1 – L. plantarum 8RA-3;

2 – L. fermentum 39;

3 – Bifidobacterium bifidum 1;

4 – Sreptococcus thermophilus 17 T;

5 – отрицательный контроль 300 (DEPC H2O);

6 – маркер размерности ДНК (п.н.).

Рис. 1. Электрофореграмма продуктов амплификации фрагмента ДНК гена 16S рРНК бактерий молочнокислого брожения с использованием пары праймеров FLg - RLg I (1) и FLg – RLg II(2) Представленные олигонуклеотиды могут составлять основу для разработки тест-систем, позволяющих проводить индикацию бактерий рода Lactobacillus в однораундовой и двухраундовой полугнездовой ПЦР.

Конструирование универсальных праймеров для амплификации фрагмента 16S рРНК лактобацилл позволило наработать фрагмент, размер которого достаточен для получения геномных характеристик, отсутствующих у штаммов, которые использовались в нашей работе. Было проведено секвенирование фрагмента гена 16S рРНК бактерий L. plantarum 8 RA-3, L.

casei 583 и L. fermentum 39, полученного при использовании пары праймеров FLg - RLg II. Нуклеотидные последовательности фрагментов гена 16S рРНК штаммов L. plantarum 8 RA-3, L. casei 583, L. fermentum 39, депонированы в GenBank под номерами FJ210723, FJ210724, FJ210725.

В работе были апробированы 3 метода выделения геномной ДНК: метод кипячения, многоэтапный метод с применением ферментативной обработки и метод нуклеосорбции. Для выделения ДНК использовали 12-ти часовую культуру. Культуры предварительно стандартизировали согласно стандарту мутности, равному 10 единицам. Данное значение оптической плотности бактериальной взвеси соответствует 109 микробных клеток в миллилитре раствора. Порог аналитической чувствительности ПЦР при использовании метода кипячения составил 10000 ГЭ/мл, при использовании метода ферментативной обработки - 100-1000 ГЭ/мл пробы, при использовании метода нуклеосорбции - 10-100 ГЭ/мл пробы. Этот метод был апробирован на различных промышленных препаратах и продуктах функционального питания, содержащих лактобациллы. (рис.2).

Представленные результаты свидетельствуют о высокой эффективности метода нуклеосорбции для выделения ДНК лактобацилл из различных субстратов и дальнейшей постановки ПЦР.

1 2 3 4 5 6 М 1 – «Активия»;

2 – «Иммунеле»;

3 – «Лактобактерин»;

4 – «Линекс»;

5 – отрицательный контроль (DEPC H2O);

6 – Положительный контроль (ДНК L.

plantarum 8RA-3);

М – маркер размерности ДНК, выраженный в п.н.

Рис. 2. Электрофореграмма продуктов амплификации фрагмента ДНК генома представителей рода Lactobacillus, содержащихся в различных субстратах 3. Разработка унифицированной схемы видовой идентификации бактерий рода Lactobacillus на основе ПЦР гена 16S рРНК и ее апробация Для создания унифицированной схемы видовой идентификации лактобацилл нами был использован принцип гнездовой ПЦР на основе фрагмента 737 п.н., получаемого в результате амплификации ДНК с использованием праймеров FLg и RLg I.

На первом этапе работы был проведен сравнительный анализ представленных в научной литературе праймеров для идентификации L.

plantarum, L. fermentum, L. acidophilus, L. casei и L. rhamnosus. Праймеры были проверены на специфичность и наличие нуклеотидных замен путем анализа выровненных нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК различных видов бактерий молочнокислого брожения и анализа сиквенсов фрагментов гена 16S рРНК штаммов L. plantarum 8 RA-3, L. fermentum 39 и L.casei 583, установленных в рамках проведенной работы. Олигонуклеотиды FERM 1, PLANT1 и CASE3 были модифицированы с учетом выявленных нуклеотидных замен. Для идентификации L. delbrueckii был сконструирован новый праймер, находящийся в области последовательности, фланкированной FLg – RLg I (RLg II). Вновь разработанный праймер FLd обладает низкой степенью гомологии относительно соответствующих регионов ДНК других бактерий молочнокислого брожения, что обеспечивает его специфичность.

Все олигонуклеотиды являются прямыми, составляют систему с праймерами RLg I и RLg II и позволяют в монопостановке или, в ряде случаев, в мультиплексной постановке, проводить идентификацию 6 видов промышленно-значимых лактобацилл (рис. 3).

753 п.н.

RLg I FLg 16SрРНК Aci 16S1 599 п.н. RLg II FLdel 590 п.н.

F rham 570 п.н.

CASE569 п.н.

PLANT567 п.н.

FERM 1 452 п.н.

Рис.3. Унифицированная комплексная схема видовой идентификации бактерий рода Lactobacillus методом гнездовой ПЦР.

Теоретическая специфичность праймеров была подтверждена экспериментально на 12 штаммах бактерий, из них 9 штаммов рода Lactobacillus, 2 штамма рода Bifidobacterium, 1 штамм рода Streptococcus и Escherichia. Оптимизированные и вновь разработанные праймеры легли в основу унифицированной комплексной схемы идентификации бактерий L. fermentum, L. plantarum, L. acidophilus, L. rhamnosus, L. casei, L. delbrueckii с использованием гнездовой ПЦР. Разработанная схема позволяет существенно повысить специфичность и чувствительность анализа, использование единого обратного праймера RLg II для идентификации всех 6-ти видов удобно, как с практической, так и с экономической точки зрения.

Проведена параллельная идентификация видов L. plantarum, L.fermentum, L.acidophilus, L. delbrueckii, L. casei, L. rhamnosus с использованием полимеразной цепной реакции и классического биохимического метода идентификации на основе сахаролитической активности (табл.3).

Таблица Результаты параллельной идентификации бактерий рода Lactobacillus с использованием биохимического метода и методики на основе «гнездовой» ПЦР № Штамм Идентификация Идентификация биохимическим методом методом гнездовой ПЦР 1 L. plantarum 8 RA-3 L. plantarum L. plantarum 2 L. plantarum 30 L. plantarum L. plantarum 3 L.fermentum 39 L.fermentum L.fermentum 4 L. fermentum 90 ТC-4 L.fermentum/ L. vaginalis L.fermentum 5 L.acidophilus АЩГ3 L.acidophilus L.acidophilus 6 L. delbrueckii 76 L. delbrueckii L. delbrueckii 7 L. casei 583 L. casei/ L. paracasei spp. L. casei paracasei / L. rhamnosus 8 L. rhamnosus 7 L. rhamnosus/ L. casei/ L. casei L. paracasei spp. paracasei 9 L. rhamnosus 1790 L. rhamnosu/s L. casei/ L. rhamnosus L. paracasei spp. paracasei Из таблицы видно полное совпадение результатов идентификации. В ряде случаев, когда биохимическая идентификация не выявляла четких различий в близкородственных штаммах по спектру утилизируемых углеводов, метод ПЦР позволил уточнить видовую принадлежность близкородственных штаммов.

4. Применение ПЦР для характеристики популяционно-ростовых свойств микроорганизмов рода Lactobacillus Применение метода совместного культивирования требует анализа межштаммовых взаимодействий микроорганизмов в условиях in vitro.

Пригодными для совместного культивирования считают биосовместимые штаммы, т.е. штаммы взаимоотношения которых расцениваются как симбиоз, мутуализм, нейтрализм или синергизм.

Известен опыт совместного культивирования комбинаций видов L. plantarum - L. salivarius и L.fermentum - L. salivarius, что свидетельствует об их высокой способности к сосуществованию [Головач Т.Н., 2004]. Совместное культивирование штаммов L. fermentum 39, L. plantarum 38 и L. paracasei 37, напротив, было неэффективно и приводило к снижению количества живых клеток микроорганизмов всех трех видов в конечном продукте [Лихачева А.Ю., 1992].

Проведено изучение межштаммовых взаимодействий 10 штаммов рода Lactobacillus: L. plantarum 8 RA-3, L.fermentum 39, L.acidophilus АЩГ3, L.

fermentum 90 ТC-4. Штаммы L. casei 577, L. plantarum 30, L. delbrueckii 76, L.

rhamnosus 1790, L.acidophilus 1660, L. casei 583 выделены из кишечника здоровых людей в лаборатории микробиоценозов и конструирования пробиотиков Нижегородского НИИЭМ и свойства их изучены лишь фрагментарно. По результатам анализа исследуемые штаммы были разделены нами на 3 условные группы: штаммы с сильной антагонистической активностью, штаммы – слабые антагонисты и штаммы со средней антагонистической активностью. К группе биосовместимых лактобацилл со средней антагонистической активностью нами были отнесены следующие штаммы: L. plantarum 8 RA-3, L. fermentum 39, L. fermentum 90 ТC-4, L.

acidophilus АЩГ3, L. casei sp. casei 583, L. acidophilus 1660 (рис. 4).

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»