WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

ТОЧИЛИНА АННА ГЕОРГИЕВНА БИОХИМИЧЕСКАЯ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ БАКТЕРИЙ РОДА LACTOBACILLUS 03.00.04 – биохимия 03.00.07 – микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Нижний Новгород – 2009 2

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени академика И.Н. Блохиной» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Н. А. Новикова доктор медицинских наук К.Я. Соколова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор А.П. Веселов кандидат биологических наук И.С. Горлова

Ведущая организация:

Нижегородская государственная медицинская академия

Защита состоится « »_2009 года в часов на заседании диссертационного совета Д 212.166.15 при Нижегородском госуниверситете им. Н.И. Лобачевского по адресу: 603950, Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского

Автореферат разослан «_»2009 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук А.С. Корягин 3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Микроорганизмы рода Lactobacillus широко распространены в природе, а некоторые виды являются важнейшими представителями микробиоты организма человека [Бондаренко В.М. и др, 2003]. Лактобациллы длительное время привлекают внимание ученых – биохимиков, микробиологов, медиков, экологов, ввиду их потенциального значения для поддержания гомеостаза системы «человек-окружающая среда», сохранения здоровья населения, профилактики и лечения многих заболеваний различной этиологии.

В настоящее время известно, что главным конечным продуктом метаболизма лактобацилл является D- и L-молочная кислота. У гомоферментативных лактобацилл лактат составляет 90% всех продуктов брожения. У представителей гетероферментативных видов в качестве конечных продуктов также образуется молочная кислота и углекислый газ [Шлегель Г., 1987]. Благодаря продукции органических кислот, перекисей и бактериоцинов многие штаммы лактобацилл проявляют выраженную антагонистическую активность в отношении патогенных и оппортунистических микроорганизмов [Quadri L.E., 2002; Kleerebezem, 2004]. Бактерии рода Lactobacillus усиливают гидролиз белков, сбраживают углеводы, омыляют жиры, препятствуют микробному декарбоксилированию пищевого гистидина и повышению количества гистамина [Воробьв А.А.и др, 1999]. В то же время актуальным является получение новых знаний о молекулярно-генетической структуре и биологических свойствах лактобацилл.

Биохимические и морфологические свойства лактобацилл являются в настоящее время основным и единственным критерием межродовой и видовой идентификации этих микроорганизмов. Альтернативой классической биохимической идентификации может стать метод генотипирования с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). Разработка новых и оптимизация известных молекулярно-генетических методик индикации и точной видовой идентификации бактерий рода Lactobacillus является актуальной, практически значимой и своевременной задачей, которой уделяется большое внимание как отечественными, так и зарубежными исследователями. Однако, несмотря на углубленное изучение этого вопроса на настоящий момент еще отсутствует оптимальная унифицированная лабораторная методика на основе ПЦР, позволяющая проводить индикацию и идентификацию видов рода Lactobacillus. Наряду с индикацией и идентификацией лактобацилл чрезвычайно важной остается проблема их использования в ряде отраслей микробиологической промышленности (пищевой, фармацевтической). В настоящее время ведется поиск новых биотехнологических подходов к культивированию продуцентов, превосходящих по эффективности раздельное, например совместное культивирование ряда видов микроорганизмов-продуцентов в случае, когда целевым продуктом является многокомпонентный препарат. Необходимым условием успешной реализации этого технологического подхода является наличие симбиотических отношений бактерий-продуцентов. При осуществлении принципа совместного культивирования наиболее пристального внимания заслуживает вопрос контроля динамики роста и количества всех штаммов на разных стадиях процесса. В этой ситуации применение унифицированных молекулярно-генетических методик на основе ПЦР позволит избежать трудоемкого и длительного процесса идентификации бактерий классическим методом.

Цель исследования На основе изучения биохимических свойств и структуры генома разработать унифицированный метод на основе ПЦР для индикации и видовой идентификации бактерий рода Lactobacillus и исследовать их межштаммовые взаимоотношения.

Задачи 1. Изучить биохимические свойства новых штаммов лактобацилл (сахаролитические свойства).

2. На основе анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК бактерий молочнокислого брожения, представленных в GenBank, подобрать композицию универсальных праймеров для индикации бактерий рода Lactobacillus.

3. Провести оценку сравнительной эффективности различных методов выделения ДНК из клеток бактерий рода Lactobacillus – ферментативного лизиса, кипячения и нуклеосорбции, для последующего проведения ПЦР.

4. Установить нуклеотидную последовательность фрагмента гена 16S рРНК следующих штаммов пробиотических лактобацилл: L. plantarum 8 RA-3, L. fermentum 39 и L. casei 583.

5. Разработать схему видовой идентификации бактерий рода Lactobacillus с использованием «гнездовой» ПЦР специфического фрагмента индикации.

6. Провести сравнение метода видовой идентификации бактерий рода Lactobacillus с использованием ПЦР и классического биохимического метода.

7. На основе изучения биологических (межштаммовых взаимодействий) и популяционно-ростовых свойств микроорганизмов рода Lactobacillus определить композицию биосовместимых штаммов для осуществления процесса совместного культивирования при создании нового многокомпонентного пробиотика и отработать методологию контроля динамики роста с использованием ПЦР.

Научная новизна Разработана новая методика ПЦР для индикации бактерий рода Lactobacillus, основанная на оригинальных (авторских) родоспецифичных праймерах FLg, RLgI и RLgII, составивших предмет патентования.

Впервые установлены нуклеотидные последовательности фрагментов гена 16S рРНК штаммов L. plantarum 8 RA-3, L. casei 583, L. fermentum 39, которые депонированы в GenBank под номерами FJ210723, FJ210724, FJ210725, что расширило международную базу нуклеотидных последовательностей генома лактобацилл.

Создана унифицированная схема видовой идентификации бактерий рода Lactobacillus с использованием гнездового варианта ПЦР, включающая авторский праймер для идентификации L. delbrueckii.

При изучении межштаммовых взаимоотношений 10 штаммов лактобацилл впервые установлена биосовместимость бактерий L. plantarum RA-3 и L. fermentum 39. Эффективность совместного выращивания, установленная нами, обосновала создание симбиотика на основе этих лактобацилл с использованием принципа совместного культивирования (Патент №2280465, приоритет от 25.10.2004).

С помощью разработанной методики определены параметры контроля динамики роста новой композиции биосовместимых штаммов вида L. plantarum 8 RA-3 и L.fermentum 39 при совместном культивировании.

Практическая значимость работы Полученные результаты позволили обосновать новые области применения ПЦР при подборе штаммов-продуцентов на этапе идентификации и для контроля штаммового состава на всех этапах производства пробиотических препаратов. Разработанная методология родовой и видовой идентификации бактерий рода Lactobacillus позволит усовершенствовать контроль технологического процесса на предприятиях по производству фармакопейных препаратов, БАД к пище и продуктов питания на основе молочнокислых микроорганизмов и поставить на новый методический уровень контроль мультиштаммовых пробиотических продуктов на соответствие НТД в органах Роспотребнадзора и Центрах сертификации.

Положения, выносимые на защиту 1. Разработанные методики на основе специфической амплификации фрагмента гена 16S рРНК позволяют проводить индикацию и видовую идентификацию пробиотических штаммов лактобацилл, сопоставимую с их классической биохимической идентификацией.

2. Штаммы L. plantarum 8 RA-3 и L. fermentum 39, относящиеся к двум разным подгруппам гетероферментативных лактобацилл, обладают синергидными взаимоотношениями, что обосновало их использование в качестве штаммов-продуцентов пробиотиков в условиях технологии совместного культивирования.

3. Разработанный метод полимеразной цепной реакции с использованием «контрольных разведений» бактериальных культур является адекватным для оценки динамики роста L. plantarum 8 RA-3 и L. fermentum 39 в условиях совместного культивирования.

Апробация работы Основные положения и результаты работы были доложены на конкурсе молодых ученых, проводимом в рамках IV съезда общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (г. Пущино, 2007 г.), на заседаниях Ученого Совета и проблемных научно-практических семинарах Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии имени академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора (2005-2008 гг.).

Структура и объем диссертации Материалы диссертации изложены на 148 страницах машинописного текста, иллюстрированы 17 рисунками и 15 таблицами. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 185 источников, из которых 108 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования В исследовании использовали:

16 штаммов рода Lactobacillus, Bifidobacterium и Streptococcus в том числе L.plantarum 8RA-3, L.plantarum 38, L.fermentum 39, L.fermentum 90-ТС-4, B.bifidum 1, B.bifidum 791, разрешенные ГИСК им. Л.А. Тарасевича в качестве производственных;

коммерческие лиофильно высушенные препараты: «Линекс» (фирма «Lek»), «Бифидумбактерин» и «Бификол» (фирма «Микроген») и коммерческие кисломолочные продукты: «Активия» и «Актимель» (фирма Danon); «Иммунеле» (фирма Вимм-Билль-Данн);

нуклеотидные последовательности гена 16S рибосомной РНК бактерий рода Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus, Leuconostoc, Lactococcus, Carnobacterium, Propionibacterium, собранные в базе данных GenBank/ EMBL/DDBJ. Всего проанализировано 43 последовательности;

компьютерные программы BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov\ BLAST), Oligo 4.0, Mega v.3.0, Mega v.4.0 (www.megasoftware.net);

питательные среды для культивирования и дифференциации молочнокислых бактерий. Для выращивания культур бактерий рода Lactobacillus использовали модифицированные питательные среды МРС (среда J. C. De Man, M. Rogosa и E. Sharpe): полужидкую, содержащую 0,15% агара (МРС-2) и плотную, содержащую 2% агара (МРС-4).

Определение принадлежности выделенных бактерий к роду Lactobacillus проводили по ГОСТ 10444.11-89 «Продукты пищевые. Методы обнаружения молочнокислых микроорганизмов»: по отношению к окраске по Граму, подвижности, наличию каталазы. Определение ферментации углеводов проводили с использованием дисков с углеводами и бульона с бромкрезоловым пурпурным производства «HiMedia Laboratories Pvt. Limited», Индия.

Для выделения ДНК использовали 12-ти часовую культуру, предварительно стандартизированную согласно стандарту мутности, равному 10 единицам. Выделение ДНК проводили с использованием метода кипячения, метода с использование лизоцима и метода нуклеосорбции Boom R. et al, 1990;

Yost C.K. et al, 2000; Torriani S. et al, 2001.

В работе использовали праймеры, сконструированные в настоящей работе, а также предложенные в научной литературе Ward L.J. et al, 1999;

Walter J. et al., 2000; Chagnaud P., 2001.

Определение нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК проводили на автоматическом секвенаторе ABI Prism 31100 и набора реагентов ABI Prism Big Dye Terminator v. 3.1., согласно рекомендациям производителя в совместной работе с к.б.н. Голицыной Л.Н. и к.б.н. Парфеновой О.В.

Нуклеотидные последовательности фрагментов ДНК использовали для идентификации штаммов лактобацилл в программе BLAST [www.ncbi.nlm.nih.gov\ BLAST].

Исследование биосовместимости лактобацилл проводили методом совместного культивирования на плотной питательной среды МРС. Были исследованы 10 штаммов лактобацилл.

Особенности динамики развития микробной популяции L.plantarum 8RA3 и L.fermentum 39 при условиях совместного и раздельного культивирования изучали методом серийных разведений на жидкой среде МДС, путем высева на плотную среду МДС-м и постановки ПЦР в контрольных точках культивирования (3, 6, 9, 12, 24, и 27 часов). Длительность фаз роста культуры определяли графически. Показатели роста культур – удельную скорость роста по количеству жизнеспособных клеток рассчитывали с помощью критерия Иерусалимского [Гланц С., 1999].

Статистическую обработку данных осуществляли общепринятым методом с использованием коэффициента Стъюдента [Гланц С., 1999].

Результаты и их обсуждение 1. Изучение биохимических свойств вновь выделенных штаммов рода Lactobacillus Изучение биохимических свойств лактобацилл, в частности способности ферментировать углеводы, является основой для видовой идентификации этих бактерий. В этом разделе работы представлены данные об изучении биохимических свойств 10 штаммов 7 видов бактерий рода Lactobacillus (культур), выделенных в лаборатории микробиоценозов и конструирования пробиотиков из фекалий здоровых детей первого года жизни: L. casei 577, L.

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»