WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Механизмы и физиологическое значение данного процесса оставались крайне плохо изученными, что и обусловило наше внимание к данному феномену.

Для идентификации сайтов модификации Ubc13 на первом этапе требовалось оптимизировать реакцию автоубиквитилирования in vitro. Ранее было показано, что автоубиквитилирование человеческого Ubc13 проходит по сайту Lys92 (McKenna et al., 2001). Нами было установлено, что кроме данного сайта, молекула дрожжевого Ubc13 содержит дополнительные сайты модификации, т.к. мутантный белок Ubc13 K92R сохраняет способность автоубиквитилироваться (рис. 4). Используемый в работе белок GST-Ubc13 в немодифицированной форме мигрирует в полиакриламидном геле с массой около 55 кДа. При использовании антител к Ubc13 были выявлены дополнительные полосы иммунореактивности в диапазоне масс от 55 до кДа, что указывает на присутствие модифицированных убиквитином форм белка.

к Ubc13 wt Ubc13 wt +Mms2 K1 K2 Ubс13 K92R Ubc13 K92R Д +Mmsа 0 2 4 0 2 4 0 2 4 0 2 Рисунок 4. Мутантный Ubc13 K92R сохраняет способность подвергаться автоубиквитилированию в отсутствие Mms2.

Антитела к Ubc13. Внизу указана продолжительность инкубации в часах.

К1 – реакционная смесь без убиквитина, К2 – реакционная смесь без Ubc13.

После оптимизации условий реакции автоубиквитилирования Ubc13 in vitro реакция была масштабирована для получения количества продукта (модифицированного Ubc13), достаточного для масс-спектрометрического анализа. Продукты реакции разделялись с помощью SDS-PAGE. После окраски геля Coommassie G250 интересующие нас полосы были вырезаны и отправлены для дальнейшего анализа в Центр анализа белков Cancer Research UK (Лондон, Великобритания). В результате анализа полученных спектров, сочетая результаты автоматического поиска и ручной обработки списка масс ионов, для Ubc13 удалось идентифицировать ряд специфических пептидов, один из которых содержит сайт убиквитилирования – Lys14 (Таблица 3).

Таблица 3.

Идентифицированные в эксперименте пептиды Ubc13.

Моноизотопная Пептид Позиция в масса, Да последовательности 790 AREWTK 140-1027 IYHPNIDR 75-1185 TNWSPALQIR 93-2045 LVSDPVPGITAEPHDDNLR 15-2646 11-ETEKLVSDPVPGITAEPHDDNLR Звездочкой помечен модифицированный лизин (Lys14).

Таким образом, в дополнение к ранее известному сайту модификации (Lys92) был идентифицирован остаток лизина, находящийся на N-конце молекулы (Lys14). Этот феномен может играть роль в регуляции активности Ubc13. Хотя вопрос о роли убиквитилирования именно остатка Lys14 в молекуле фермента требует дальнейшего изучения, уже сейчас можно сказать, что такая модификация скорее всего не ведет к деградации белка в протеасоме, так как нами было показано, что ранее неизвестные сайты убиквитилирования преимущественно модифицируются Lys63-полимеризованными цепями (данные не показаны). Такая модификация может служить специфическим сигналом для узнавания Ubc13 белками-партнерами, имеющими соответствующие убиквитин-связывающие домены. С другой стороны, возможно и ограничение взаимодействия фермента с такими белками из-за перекрывания специфических зон узнавания присоединенной молекулой убиквитина. Возможно, автоубиквитилирование Ubc13 по одному или нескольким сайтам в отсутствие Mms2 – своего рода блокирующий механизм, делающий образование комплексов с любыми другими белками-партнерами невозможным.

Известно, что Ubc13 в качестве фермента E2 способен взаимодействовать с несколькими RING-доменными убиквитинлигазами, в том числе с TRAF(Deng et al., 2000) и Rad5 (Ulrich, 2003). По данным ряда исследователей, это взаимодействие осуществляется через связывание RING-домена с областью Nконца Ubc13 (Zheng et al., 2000; Moraes et al., 2001; Chan et al., 2001). Как видно из рис. 5, идентифицированный нами сайт модификации находится непосредственно в зоне взаимодействия. Этот факт позволяет предположить, что автоубиквитилирование по Lys14 способно предотвращать взаимодействие Ubc13 c Rad5, TRAF6 и другими RING-доменными лигазами в отсутствие Mms2. Для решения этого вопроса необходимо в дальнейшем точно определить области взаимодействия Ubc13 с белками-партнерами.

Рисунок 5. Схема взаимодействия комплекса Ubc13/Mms2 с убиквитином и Е3 лигазой.

А-Уб – «акцепторная» молекула убиквитина;

Д-Уб – «донорная» молекула убиквитина;

RING – функциональный домен Е3 лигазы.

Светлым кружком обозначен активный центр Ubc13, черными – сайты автоубиквитилирования.

Автоубиквитилирование Ubc13 может иметь серьезные физиологические последствия в силу критической роли данного фермента в процессах репарации ДНК. В клетках эукариот существует система преодоления репликативного блока, позволяющая продолжить репликацию без удаления повреждений и включающая 2 пути. В первом случае включаются специализированные полимеразы с низкоспецифичными активными центрами, реплицирующие поврежденную ДНК с высокой вероятностью образования мутаций (т.н. errorprone translesion synthesis). Второй вариант – исключение полимеразой поврежденных участков и считывание неповрежденной информации с новосинтезированной комплементарной цепи. Переключение между этими двумя путями осуществляется через варьирование паттерна модификации белка PCNA (Shelter, Ulrich, 2003). Моноубиквитилирование этого белка лигазным комплексом Rad6-Rad18 запускает мутагенную быструю репарацию, мультиубиквитилирование комплексом Ubc13/Mms2-Rad5 – безошибочную аккуратную обработку поврежденных участков специализированными полимеразами (см. схему на рис. 6). При этом E3 лигаза Rad5 пришивает к PCNA длинную мультиубиквитновую цепь, заранее собранную комплексом Ubc13/Mms2. Специфичность полимеризации цепи по Lys63 определяет белок Mms2, роль которого заключается в правильном ориентировании остатков убиквитина. Таким образом, автоубиквитилирование Ubc13 может предотвращать ассоциацию последнего с лигазой Rad5 в отсутствие Mms2, что позволяет избежать неспецифического убиквитилирования субстрата неправильно собранной мультиубиквитиновой цепью.

Рисунок 6. Схема переключения между двумя путями пострепликативной репарации ДНК за счет убиквитилирования белка PCNA (по Ulrich, 2007, с изменениями).

Такая модификация Ubc13 может быть «вышестоящим» механизмом переключения между двумя вышеописанными путями репарации. В результате нарушения сборки функционально активного комплекса Ubc13/Mms2-Radрепарационные процессы могут переключаются на альтернативный мутагенный путь.

In silico исследование влияния убиквитилирования на функциональную активность белков-мишеней Идентификация точек убиквитилирования для множества разнообразных белков делает возможным системный анализ феномена убиквитилирования, т.е.

изучение как механизмов самого убиквитилирования, так и последствий данного процесса для белков-мишеней. Особый интерес представляет изучение непротеолитических регуляторных эффектов убиквитилирования, так как далеко не все убиквитилированные белки подвергаются протеасомной деградации. Обнаруженные в данной работе сайты модификации EGFR и Ubc13 также позволили нам оценить влияние убиквитилирования на судьбу этих белков. Полученные нами данные свидетельствуют, что убиквитилирование как EGFR, так и Ubc13 не ведет к протеасомной деградации этих белков, а следовательно, имеет регуляторный характер. Регуляторные эффекты в данном случае могут реализовываться за счет влияния убиквитилирования на белок-белковые взаимодействия. Механизм подобной регуляции представляет особый интерес для изучения, вследствие почти полного отсутствия литературных сведений о его реализации. Поэтому нашей задачей на данном этапе работы было предсказание возможного прямого влияния убиквитилирования на функциональные свойства белков-мишеней.

Для систематизации большого количества разрозненных данных об убиквитилированных белках, с целью сделать эти данные доступными для проведения комплексного анализа, нами была создана специализированная база данных UbiProt (http://ubiprot.org.ru). В настоящее время в базе данных представлена информация о более чем 400 индивидуальных белках из различных организмов; процесс внесения новых записей продолжается. Каждая запись состоит из блоков, объединенных на отдельной странице. Первый информационный блок содержит общие характеристики белка - название и синонимы, гены, организм-источник, а также общие свойства белковой молекулы – молекулярная масса, полная длина и длина зрелой формы. Второй блок описывает особенности убиквитилирования белка и включает описание модифицируемого остатка/остатков лизина, а также тип убиквитилирования – количество присоединяемых молекул убиквитина и структуру разветвленных мультиубиквитиновых цепей. Следующий информационный блок посвящен ферментам системы убиквитилированиядеубиквитилирования - убиквитин-конъюгирующим белкам, убиквитинпротеин лигазам, деубиквитилирующим ферментам и неферментативным адапторным белкам, в случае, если эти компоненты известны. Каждая запись содержит также ссылки на статьи, из которых получена информация об убиквитилировании данного белка. Кроме того представлена перекрестная ссылка на соответствующую запись в Swiss-Prot/TrEMBL. В случае, если для белка представлена пространственная структура, дается ссылка на соответствующую запись Protein Data Bank. База данных оснащена полнотекстовой поисковой системой, использующей логические операторы.

Из всего массива данных, депонированных в UbiProt, для дальнейшего анализа были отобраны растворимые белки с известными точками убиквитилирования, содержащие охарактеризованные функциональные домены. Необходимым условием было также наличие экспериментальных данных о пространственной организации, или возможность моделирования структуры с высокой степень достоверности.

В итоге были проанализированы следующие белки: дрожжевые ферменты оротидин 5’-фосфат декарбоксилаза (ODC) и пероксисомальная цитрат синтаза (PCS), кальмодулин позвоночных (CaM) и Х-связанный ингибитор апоптоза (XIAP). Для проверки гипотезы о возможном прямом влиянии убиквитилирования на функциональную активность белков-мишеней был проведен анализ взаимного расположения сайтов убиквитилирования и функционально важных доменов выбранных белков. Пример колокализации акцепторных лизинов и аминокислот активного центра фермента показан на рис. 7. В приведенном примере рассматривалось убиквитилирование оротидин 5’-фосфат декарбоксилазы (ODC) В работе (Peng et al., 2003) идентифицировано 3 сайта убиквитилирования ODC: Lys93, Lys209 и Lys253.

Анализ участия Lys93 в каталитическом акте показывает, что -аминогруппа этого лизина участвует в формировании водородных связей с субстратом и Asp96 другой субъединицы (Miller et al., 2000). Таким образом, убиквитилирование белка по Lys93 и соответственно блокирование его аминогруппы будет приводить к полной потере ферментативной активности.

Это согласуется с данными литературы о потере активности при замене этого лизина на цистеин (Smiley, Jones, 1992). Кроме того, ODC проявляет свою ферментативную активность в гомодимерном состоянии. Анализ поверхности димера показал, что акцепторный Lys93 находится в глубине активного центра, который сформирован обеими субъединицами ODC (рис. 7).

Таким образом, внедрение убиквитина в область активного центра будет нарушать взаимодействие субъединиц.

Рисунок 7. Поверхность димера оротидин 5’-фосфат декарбоксилазы (ODC), доступная для растворителя, с отмеченными аминокислотами активного центра и акцепторными лизинами. Две субъединицы ODC отмечены соответственно светло- и темно-серым. Аминокислоты активного центра заштрихованы. Сайты убиквитилирования выделены черным.

Экспонированность 3-х потенциальных акцепторных лизинов в димерной форме ODC убывает в ряду 253–209–93. Экспонированность этих лизинов в мономерной форме практически одинакова. Это позволяет предположить, что Lys93 может быть модифицирован только в мономерной форме ODC. Lys209, который также может убиквитилироваться, находится очень близко к активному центру, и его модификация также может затрагивать связывание субстрата. Lys253 же расположен относительно далеко от активного центра, и его убиквитилирование не может вести к тем же последствиям с точки зрения стерической регуляции.

Проведенный in silico анализ выявил следующие прямые эффекты присоединения убиквитина, затрагивающие функциональную активность белков-мишеней:

1. убиквитилирование может стерически блокировать или ограничивать доступность функциональные домены и/или активный центр белкамишени, как это было показано для ODC и PCS (рис. 8,А);

2. также оно может препятствовать гомо-олигомеризации, как в случае с ODC и PCS (рис. 8,В), и влиять на гетерологические взаимодействия белков, мешая связыванию белков-мишеней с их партнерами, как в случае с XIAP и CaM;

3. взаимодействие с белками-партнерами также может нарушаться из-за ограничения конформационной подвижности, что наблюдается на примере кальмодулина.

А – ограничение доступности активного центра. Последовательно показаны: активный фермент;

модификация лизина в активном центре; модификация лизина около «входа» в полость активного центра.

А В – нарушение формирования активного димера. Последовательно показаны: функциональный димер;

модификация лизина в области межсубъединичного контакта;

модификация рядом с областью В контакта.

Рисунок 8. Схема реализации прямых эффектов убиквитилирования (на примере ферментов ODC и PCS).

Весь спектр рассматриваемых эффектов реализуется за счет стерических ограничений, вносимых присоединением к молекуле фермента крупного модификатора. Особенно важно отметить, что для рассмотренных в данной работе белков реализация таких эффектов напрямую зависит от убиквитилирования конкретных остатков лизина, т.е. является сайтспецифичной. Любой из этих эффектов будет вести к падению активности модифицируемого белка. Таким образом, мы предполагаем наличие нового механизма регуляции белков за счет убиквитилирования. Следует отметить, что функциональные нарушения могут предшествовать дальнейшей убиквитинзависимой трансформации белка-мишени, например, протеасомальной деградации. В то же время представляется вероятным, что влияние убиквитилирования на функцию ряда белков крайне важно с точки зрения регуляции и не зависит от катаболической функции, так как убиквитилирование обратимо. Под действием специфических деубиквитилирующих ферментов может происходить отщепление убиквитина от белка-мишени, что в рассматриваемых случаях будет сопровождаться восстановлением функции белков-мишеней.

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»