WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии SDS Электрофорез в геле проводили по методу Лэммли (Laemmli et al., 1970) с использованием камеры Mini Protean (Bio-Rad). При необходимости белки перед нанесением концентрировали осаждением в 10% растворе ТХУ. Осажденные белки растворяли в буфере для проб (0,0625 М Tris-HCl, pH 6,8, 10% глицерин, 0,001% бромфеноловый синий, 5% -меркаптоэтанол, 2,3% SDS), рН 6,8. По окончании электрофореза гель использовали для последующего иммуноблоттинга или окрашивали 30-60 мин в растворе, содержащим Coomassie Blue R250, 40% метанола, 10% уксусной кислоты. Несвязанный краситель удаляли отмывкой геля в растворителе (40% метанол, 10% уксусная кислота).

Иммуноблоттинг Белки переносили из полиакриламидного геля на мембрану методом полусухого или мокрого переноса с помощью блоттеров Bio-Rad. Использовали поливинилиден-дифлюоридную (PVDF) мембрану Problot–Membran (Applied BioSystems) или нитроцеллюлозную мембрану Immobilon-P (Millipore). Визуализация результатов блоттинга проводилась с помощью метода хемилюминисценции, в соответствии с методическими рекомендациями производителя набора для детекции ЕСL Western Blotting Analysis System (Amersham Biosciences).

Трипсинолиз и экстракция пептидов Вырезанные из полиакриламидного геля белок-содержащие полосы измельчались скальпелем и многократно промывались смесью ацетонитрила и 50 mM бикарбоната аммония в равных объемных долях для удаления красителя. После добавления к кускам геля рабочего раствора трипсина (50 нг модифицированного свиного трипсина в 10 мкл 50 mM раствора аммония бикарбоната) пробы оставлялись на льду на 20 мин для вхождения трипсина в гель. Затем добавляли 30 мкл 50 mM раствора бикарбоната аммония и инкубировали пробы 4 часа при температуре 37°С.

После инкубации пептиды экстрагировали из геля 5% муравьиной кислотой и высушивали на SpeedVac (Thermo Savant).

Масс-спектрометрия с MALDI-ионизацией Высушенные экстракты пептидов ресуспендировали в растворе 50% (v/v) ацетонитрила и 0,1% (v/v) трифторуксусной кислоты и наносили на мишень MALDI в смеси с эквивалентным количеством раствора матрицы (альфа-циано-4-гидрокси-Вфенилакриловая кислота в концентрации 10 мкг/мкл). Раствор матрицы также содержал 20 фемтомолей ангиотензина I в качестве внутреннего стандарта калибровки и 3,3 наномоля монофосфата аммония для подавления образования побочных продуктов. Нанесенный на мишень раствор высушивали и анализировали на времяпролетном масс-спектрометре ABI 4700 Proteomic Analyser (Applied Biosystems). Сгенерированные спектры калибровали по пикам пептидов, соответствующих ангиотензину I (1296,6853 а.м.е.) и/или продуктам автолиза трипсина (842,5100 а.м.е. и 2211,1046 а.м.е.) с помощью программного пакета ABI Data Explorer (Applied Biosystems). Поиск совпадений масс пептидов проводили по базе данных NCBInr с помощью инструмента Protein Prospector MS-FIT (http://prospector.ucsf.edu/).

Масс-спектрометрия ионно-циклотронного резонанса Смесь триптических пептидов в растворе 50% (v/v) ацетонитрила и 0,1% (v/v) трифторуксусной кислоты анализировалась на гибридном масс-спектрометре LTQ-FT (Thermo Electron) с HPLC-хроматографом Agilent 1100 (Agilent Technologies).

Пептиды вначале загружали в микрокапиллярную колонку с материалом С18 для обратнофазовой хроматографии. Элюирование пептидов проводили линейным градиентом 5-40% буфера А (97,5% ацетонитрил/0,15% муравьиная кислота) в буфере Б (2,5% ацетонитрил/0,15% муравьиная кислота). Разделенные фракции напрямую поступали в масс-спектрометр. Снятие спектров проходило в режиме автоматического переключения на тандемную масс-спектрометрию в зависимости от интенсивности сигнала. Полученные спектры анализировались с помощью алгоритма Phenyx (http://phenyx.vital-it.ch/pwi/) c использованием баз данных белковых последовательностей NCBInr и Swiss-Prot, с обязательной ручной верификацией результатов.

Биоинформатический анализ убиквитилирования белков Аминокислотные последовательности анализируемых белков были взяты из базы данных Swiss-Prot (http://www.expasy.org/sprot/) (Gasteiger et al., 2003), известные 3D структуры – из базы данных Protein Data Bank (PDB, http://www.rcsb.org/pdb/) (Berman et al., 2000). В случае отсутствия известных 3D структур проводили сравнительное моделирование пространственной структуры белковой глобулы с помощью сервиса Swiss-Model (Automated Comparative Protein Modelling Server, http://swissmodel.expasy.org) (Schwede et al., 2003).

Последовательность активного центра выявляли с помощью инструмента ScanProsite (http://www.expasy.org/tools/scanprosite/) (Gattiker et al., 2002). Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей проводили с помощью программы ClustalW (http://www.ch.embnet.org/software/ClustalW.htm) (Thompson et al., 1994). Локальная программа BioEdit Sequence Alignment Editor 7.0.5.(http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html) (Hall, 1999) использовалась для попарного выравнивания последовательностей. Выравнивание трехмерных структур производилось методом комбинаторного растягивания (http://cl.sdsc.edu/ce.html) (Shindyalov and Bourne, 1998). Участие аминокислот в межсубъединичных контактах рассчитывалось при помощи Protein-Protein Interaction Server v.1.(http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/PP/server/) (Jones and Thornton, 1996). Для визуализации результатов и анализа моделей использовалась программа SwissPdbViewer (Guex and Peitsch, 1997).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ In vivo исследование убиквитилирования рецептора эпидермального фактора роста Данная часть работы выполнялась совместно с Лабораторией динамики внутриклеточных мембран Отдела внутриклеточной сигнализации и транспорта Института цитологии РАН, г. Санкт-Петербург (зав. лабораторией – проф. Е.С.

Корнилова). На данном этапе ставилась задача проанализировать механизмы убиквитилирования рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) в процессе эндоцитоза данного белка и осуществления им сигнальной функции.

EGFR – один из ключевых компонентов каскада передачи сигнала в клетках высших эукариот. В ответ на связывание лиганда рецептор димеризуется, в результате активируется его тирозинкиназа, фосфорилирующая тирозины в области С-конца рецептора (Ullrich, Schlessinger, 1990). Активация тирозинкиназы в результате образования лиганд-рецепторного комплекса необходима для стимуляции всех внутриклеточных сигналов, идущих с рецептора ЭФР. Фосфорилированные тирозины затем узнаются белком c-Cbl, который убиквитилирует EGFR.

Нами было установлено, что паттерн убиквитилирования рецептора меняется в зависимости от прогрессии ЭФР-индуцированного эндоцитоза. В клетках эпидермоидной карциномы человека A431 максимум убиквитилирования EGFR приходится на 30 минут после запуска эндоцитоза (рис. 1). На стадии 90 минут уровень убиквитилирования заметно падает, причем это изменение коррелирует с падением уровня фосфорилирования.

Эти наблюдения подтверждаются полученными ранее данными (Melikova et al., 2006).

Рисунок 1. Паттерны модификации EGFR на разных стадиях эндоцитоза.

Нами было проведено выделение модифицированных форм рецептора на разных стадиях эндоцитоза, соответствующих 5, 30 и 60 минутам после запуска ЭФР-стимулированного эндоцитоза, с помощью иммунопреципитации. Далее выделенные модифицированные формы рецептора анализировались массспектрометрически. В пробе, соответствующей поздней стадии эндоцитоза (минут после добавления ЭФР) было успешно идентифицировано несколько модифицированных пептидов, сводная информация по которым представлена в таблице 1.

Таблица 1.

Обнаруженные в эксперименте модифицированные пептиды EGFR.

Пептид Модификация Модифицированный остаток VLGSGAFGTVYK Убиквитилирование KVKIPVAIK Убиквитилирование KSLKEISDGDVIISGNK Убиквитилирование KELVEPLTPSGEAPNQALLR Фосфорилирование TRPAGSVQNPVYHNQPLNPAPSR Фосфорилирование YОбнаружение фосфорилированного тирозина Y1086 одновременно с убиквитилированными сайтами указывает на тесную взаимосвязь между этими пост-трансляционными модификациями. Данный остаток тирозина в фосфорилированной форме вместе с Y1068 и Y1101 служит сайтом связывания адаптерного белка Grb2, с помощью которого осуществляется непрямое связывание рецептора с убиквитин-протеин лигазой c-Cbl. Известно, что фосфорилирование 3-х остатков тирозина на С-конце EGFR, в том числе и Y1086, необходимо для изменения конформации этого участка (Bishayee et al., 1999). Фосфорилирование даже по минорным сайтам способно сильно влиять на конформацию молекулы рецептора. В свою очередь, изменение конформации С-конца может быть существенным для ассоциации рецептора с убиквитин-лигазой c-Cbl и последующего убиквитилирования. Это подтверждается данными эксперимента по убиквитилированию мутантного EGFR с С-концевыми делециями, а также с инактивированным тирозинкиназным доменом рецептора (рис. 2).

В данной части работы было исследовано влияние С-концевого домена на убиквитилирование EGFR в процессе ЭФР-индуцированного эндоцитоза. В качестве модели использовалась панель клеточных линий NIH3Т3, экспрессирующих человеческий рецептор дикого типа (линия HER14), рецептор, лишенный тирозинкиназной активности (К721R), и укороченные формы рецептора с делециями 63, 123 или 165 С-концевых аминокислот (CD63, CD123 и CD165, соответственно). В таблице 2 представлена подробная характеристика клеточных линий по наличию в экспрессируемом рецепторе функционально значимых аминокислотных остатков.

Таблица 2.

Характеристика использованных в эксперименте клеточных линий.

Клеточная Сайт прямого Сайты непрямого связываия Активный линия связывания c- c-Cbl (через Grb2) центр Cbl тирозинкиназы Y1045 Y1068 Y1086 Y1101 КHER14 (WT) + + + + + CD63 + + + + + CD123 + - - - + CD165 - - - - + K721R + + + + - (замена KR) Рисунок 2. Делеции в С-концевом домене EGFR вызывают снижение убиквитилирования рецептора.

Таким образом, С-концевой домен длиной в 63 аминокислотных остатка играет важную роль в модуляции степени убиквитилирования, несмотря на отсутствие в нем известных сайтов связывания с c-Cbl. При этом сайты непрямого связывания EGFR с убиквитин-лигазой, локализованные несколько дальше от С-конца, необходимы для достижения высокой степени модифицированности рецептора.

Нами были идентифицированы 3 ранее неизвестных сайта убиквитилирования в молекуле EGFR, 2 из которых находятся в тирозинкиназном домене, и 1 – во внеклеточном лиганд-связывающем домене.

Ранее в работе проф. Соркина и коллег также было идентифицировано несколько сайтов убиквитилирования в тирозинкиназном домене рецептора (Huang et al., 2006) и показано, что такая модификация регулирует сортировку и деградацию EGFR в лизосомах. Интересно, что обнаруженные нами сайты модификации не совпадают с идентифицированными группой Соркина, хотя также локализованы в тирозинкиназном домене (рис. 3).

Рисунок 3. Локализация идентифицированных сайтов модификации в различных доменах молекулы EGFR. Черным цветом показаны ранее идентифицированные сайты (Huang et al., 2006); штриховкой – обнаруженные в настоящей работе. ПМ – плазматическая мембрана.

Это может свидетельствовать о специфической роли в процессе распознавания не столько самих точек убиквитилирования, сколько архитектуры мультиубиквитиновых цепей. С другой стороны, в результате деятельности деубиквитилирующих ферментов и c-Cbl паттерн модификации может меняться очень быстро. Сотрудники Соркина использовали культуру клеток эпителия аорты свиньи PAE II и наблюдали убиквитилирование после минут протекания эндоцитоза (Huang et al., 2006), в то время как мы изучали паттерн модификации в клетках А431 на 4-х разных стадиях эндоцитоза, что может объяснять различия в идентифицированных сайтах. Следует отметить, что выбор временной точки в работе Соркина и коллег не совсем релевантен, т.к. в течение 2 минут эндоцитоза может быть эффективно интернализовано не более 10% молекул активированного рецептора (Корнилова и др., 1987), а следовательно, данная точка не отражает картины внутриклеточной сортировки рецепторных комплексов.

Идентифицированные нами сайты убиквитилирования были найдены в пробе, соответствующей 60 минутам после запуска эндоцитоза в клетках. В клетках А431 данная временная точка примерно соответствует поздней стадии внутриклеточной сортировки EGFR, на которой интернализованный рецептор переходит из ранних эндосом в поздние. При этом для прохождения данной стадии необходимо доубиквитилирование рецептора (Melikova et al., 2006). В совокупности эти данные свидетельствуют, что для эффективной сортировки рецептора в поздние эндосомы и последущей деградации в лизосомах могут быть важны не столько определенные сайты убиквитилирования, сколько степень модификации, т.е. большое число присоединенных молекул убиквитина.

Особенно интересен факт обнаружения акцепторного лизина во внеклеточном домене рецептора. Принято считать, что убиквитилирование – процесс исключительно внутриклеточный, соответственно молекула EGFR также конститутивно убиквитилируется внутри клетки. Однако ручной анализ спектров подтвердил достоверность идентификации Lys430 в качестве сайта убиквитилирования. Кроме того, в литературе присутствуют свидетельства о существовании внеклеточной убиквитин-конъгирующей системы (Sawada et al., 2002; Sakai et al., 2003; Sakai et al., 2004; Baska et al., 2007). Таким образом, модификация внеклеточной части молекулы рецептора представляется вполне вероятной. Если в дальнейшем возможность убиквитилирования молекулы EGFR во внеклеточном домене подтвердится, это может привести к открытию совершенно нового механизма регуляции за счет присоединения убиквитина.

Можно предположить, что убиквитилирование во внеклеточном домене будет интерферировать со способностью рецептора связывать лиганд и, таким образом, предотвращать активацию EGFR.

Изучение механизма автоубиквитилирования дрожжевого убиквитинконъюгирующего фермента Ubc13 in vitro Данная часть работы проводилась совместно с Лабораторией устойчивости к повреждениям ДНК Лондонского исследовательского института Cancer Research UK (руководитель лаборатории – д-р Хелле Ульрих).

Объектом для исследования убиквитилирования in vitro послужил белок Ubc– компонент Е2 комплекса убиквитин-протеин лигазы из пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Комплекс Ubc13 с адаптерным белком Mmsсинтезирует длинные мультиубиквитиновые цепи, полимеризованные по лизину-63, и взаимодействует с Е3-ферментом Rad5 в так называемом Rad6пути пострепликативной репарации ДНК (Ulrich, 2000). Интересно, что в случае отсутствия адаптера Mms2, Ubc13 катализирует реакцию переноса убиквитина на собственные остатки лизинов, т.е. автоубиквитилируется.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»