WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

На правах рукописи

ЧЕРНОРУДСКИЙ АЛЕКСАНДР ЛЕОНИДОВИЧ РЕГУЛЯЦИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ БЕЛКОВ ЗА СЧЕТ САЙТ-СПЕЦИФИЧНОГО УБИКВИТИЛИРОВАНИЯ 03.00.04 – биохимия 03.00.13 – физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Нижний Новгород 2008 2

Работа выполнена на базе кафедры физиологии и биохимии человека и животных Нижегородского государственного университета им. Н.И.

Лобачевского и группы постгеномных технологий Научно-исследовательского института прикладной и фундаментальной медицины Нижегородской государственной медицинской академии.

Научные руководители: доктор биологических наук, доцент Корягин Александр Сергеевич кандидат медицинских наук Гайнуллин Мурат Рушанович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Новиков Виктор Владимирович кандидат биологических наук Мошковский Сергей Александрович

Ведущая организация: ФГУ «Научно-исследовательский институт физикохимической медицины Росздрава»

Защита диссертации состоится «» _ 2008 г. в _ часов на заседании диссертационного совета Д 212.166.15 при Нижегородском государственном университете им. Н.И. Лобачевского по адресу: 603950, Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ННГУ им.

Н.И.Лобачевского Автореферат разослан «» 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, доцент Корягин А.С.

3 Список сокращений а.м.е. – абсолютные массовые единицы ЭФР – эпидермальный фактор роста CaM – кальмодулин Е1– убиквитин-активирующий фермент Е2 – убиквитин-конъюгирующий фермент Е3 – убиквитин-протеин лигаза EGFR – рецептор эпидермального фактора роста MALDI – матричная лазерная десорбция/ионизация ODC – оротидин 5’-фосфат декарбоксилаза PCS – пероксисомальная цитрат синтаза SDS-PAGE – электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия XIAP – X-связанный ингибитор апоптоза

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Убиквитилирование представляет собой ковалентное присоединение небольшого белка убиквитина к акцепторному лизину, экспонированному на поверхности белка-мишени. Модифицированный таким образом лизин принято называть сайтом убиквитилирования. Молекула убиквитина содержит остатков лизина, которые также могут служить сайтами убиквитилирования. В результате полимеризации нескольких молекул убиквитина формируются так называемые мультиубиквитиновые цепи, структура которых может варьировать. Показана множественность форм модификации белков убиквитином.

Процесс убиквитилирования катализируется иерархическим каскадом из 3-х ферментов: убиквитин-активирующего фермента Е1, убиквитинконъюгирующего фермента Е2 и убиквитинлигазы Е3. Следует отметить, что убиквитилирование обратимо, так как разнообразные деубиквитилирующие ферменты (DUBs) способны отщеплять убиквитин от субстратов, а также расщеплять мультиубиквитиновые цепи.

Механизмы убиквитин-зависимой регуляции контролируют большинство клеточных процессов эукариот. За счет модификации разнообразных белковмишеней убиквитилирование участвует в регуляции таких важнейших клеточных процессов, как пролиферация и дифференцировка, репарация ДНК, передача внутриклеточного сигнала, апоптоз и иммунный ответ. Естественно, что любой сбой в системе убиквитина ведет к развитию разного рода патологий, в том числе злокачественных новообразований и нейродегенеративных заболеваний. Регуляторное значение убиквитилирования для физиологии клетки вполне сопоставимо со значением фосфорилирования, а по разнообразию осуществляемых через него функций превосходит все известные посттрансляционные модификации. Все это определяет актуальность исследований в данной области.

При этом далеко не все убиквитин-зависимые механизмы на сегодняшний день полно охарактеризованы. Это связано с тем, что кодируемый убиквитилированием сигнал гетерогенен и определяется как типом модификации (присоединение одного остатка убиквитина или мультиубиквитиновых цепей различного строения), так и специфичностью сайтов убиквитилирования. Изучение механизмов и молекулярнофизиологических последствий убиквитилирования невозможно без определения специфических сайтов модификации, так как присоединение убиквитина по разным остаткам лизина различным образом влияет на судьбу белка-мишени и может давать старт различным клеточным процессам.

Прямая идентификация сайтов убиквитилирования открывает возможности для анализа пространственного расположения присоединенного остатка убиквитина по отношению к функционально важным участкам поверхности белка-мишени. Это позволяет анализировать и прогнозировать прямые эффекты убиквитилирования, реализующиеся на уровне индивидуального белка-мишени и непосредственно затрагивающие его функциональную активность.

Цели и задачи исследования Цель работы – идентифицировать сайты убиквитилирования ряда белков и определить функциональное значение данных сайтов в регуляторном контексте. В качестве объектов исследования были выбраны 2 различных клеточных процесса:

1) Убиквитин-зависимая внутриклеточная передача сигнала с участием рецептора эпидермального фактора роста;

2) Убиквитин-зависимый механизм репарации ДНК у дрожжей, опосредованный ферментативным комплексом Ubc13/Mms2.

В соответствии с целью и выбором объектов исследования были поставлены следующие задачи:

1) Проанализировать механизм убиквитилирования рецептора ЭФР и определить сайты модификации в процессе эндоцитоза с помощью методов масс-спектрометрии;

2) Идентифицировать сайты модификации в процессе аутоубиквитилирования фермента Ubc13 in vitro;

3) Проанализировать функциональное значение обнаруженных сайтов модификации с точки зрения молекулярно-физиологических последствий убиквитилирования;

4) На основании полученных данных и in silico анализа выявить возможный механизм прямого влияния убиквитилирования на функциональные свойства белков-мишеней.

Научная новизна Впервые с помощью методов масс-спектрометрии идентифицированы сайты убиквитилирования рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) на поздней стадии эндоцитоза. Обнаружено, что молекула EGFR может подвергаться убиквитилированию во внеклеточном лиганд-связывающем домене.

Впервые показано, что дрожжевой убиквитин-конъюгирующий фермент Ubc13 подвергается автоубиквитилированию в области N-конца.

Предполагается, что такая модификация может регулировать переключение между различными путями репарации ДНК.

Впервые с помощью методов биоинформатики проанализированы пространственные структуры ряда убиквитин-белковых конъюгатов и предложен механизм прямого действия убиквитилирования на функциональную активность белков-мишеней, реализующийся за счет стерических ограничений.

Научно-практическая значимость Результаты работы имеют большое значение для дальнейшего углубленного изучения убиквитин-зависимых метаболических процессов. В частности, в работе получены новые данные об участии убиквитина в процессах пострепликативной репарации ДНК и внутриклеточной передачи сигнала с участием рецептора эпидермального фактора роста. Ввиду огромного значения этих процессов для жизнедеятельности клетки и участия рассматриваемых систем в патогенезе рака, полученные в работе данные могут служить теоретической основой для разработки терапевтических подходов к лечению злокачественных новообразований. Используемый в данной работе экспериментальный подход, основанный на сочетании методов протеомики и биоинформатики, может в дальнейшем использоваться для анализа разнообразных молекулярно-физиологических процессов. Материалы диссертации могут быть использованы в учебных лекционных курсах по биохимии и биоинформатике.

Основные положения, выносимые на защиту 1. Убиквитилирование белка EGFR в процессе эндоцитоза – крайне динамичный процесс, характеризующийся наличием разнообразных модифицированных форм, отличающихся между собой как сайтами убиквитилирования, так и числом присоединенных молекул убиквитина.

При этом эффективность убиквитилирования EGFR зависит от активности тирозинкиназного домена рецептора и наличия полноразмерного С-конца, который необходим для достижения высокой степени модифицированности.

2. Дрожжевой убиквитин-конъюгирующий фермент Ubc13 при отсутствии адаптерного белка Mms2 способен автоубиквитилироваться по нескольким остаткам лизина. Автоубиквитилирование белка Ubc13 по остатку лизина, находящемуся на N-конце молекулы (Lys14), не ведет к протеасомной деградации Ubc13. Такая модификация может блокировать сборку комплексов Ubc13 c убиквитинлигазами в отсутствие Mms2.

Данный механизм предположительно задействован в переключении процессов пострепликативной репарации ДНК с безошибочного на мутагенный путь.

3. Присоединение убиквитина может напрямую влиять на функциональную активность белка-мишени за счет реализации стерических эффектов, вызванных перекрыванием молекулой убиквитина функционально важных зон на поверхности субстрата. Этот регуляторный феномен имеет сайт-специфичный характер.

Апробация работы Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на симпозиумах и конференциях:

- 30th FEBS Congress & 9th IUBMB Conference “Protein World” (Budapest, Hungary, 2005) - XVIII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2006) - 5th International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure (Novosibirsk, Russia, 2006) - EMBO Practical Course “Ubiquitin and SUMO” (Split, Croatia, 2006) - EMBO Practical Course “Bioinformatics for Mass Spectrometry in Proteomics” (Les Diablerets, Switzerland, 2006) - Annual joint meeting of the Genetics Society and the British Societies for the Cell and Developmental Biology (Edinburgh, UK, 2007) - 4th International Symposium on Computational Methods in Toxicology and Pharmacology Integrating Internet Resources (Moscow, Russia, 2007) - EMBO Conference “Ubiquitin and Ubiquitin-like Modifiers in Cellular Regulation” (Riva Del Garda, Italy, 2007) - II Съезд Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2007) Структура и объем диссертации Диссертация изложена на страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, методической части, полученных результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы ( источник).

Работа иллюстрирована рисунками и содержит таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы Реактивы Все использованные реактивы были аналитического качества или лучше, производства фирм Sigma, Reanal и др. Для приготовления всех использованных в работе растворов использовалась вода высшей степени очистки MilliQ, полученная на установке фирмы Millipore.

Рекомбинантные белки Дрожжевые белки GST-Ubc13, GST-Ubc13 K92R и Mms2, а также убиквитин-активирующие ферменты Е1 человека, пшеницы и дрожжей были ранее получены в лаборатории д-ра Ульрих (Cancer Research UK).

Также использовали белок Е1 млекопитающих производства Boston Biochem. В работе использовался убиквитин дикого типа из эритроцитов коровы (Sigma) и мутантные формы убиквитина с заменой на аргинин лизина 63 (K63R) или всех остальных лизинов убиквитина (K63only)(Boston Biochem).

Антитела В работе были использованы кроличьи поликлональные антитела к следующим антигенам: убиквитин (DAKO), EGFR (Cell Signaling), Ubc13 (Boston Biochem); а также мышиные моноклональные к экстраклеточному домену EGFR (Sigma), белку с-Cbl (Cell Signaling) и фосфотирозину (Sigma). В качестве вторичных антител при иммуноблоттинге использовали козьи антитела, полученные против иммуноглобулинов кролика, сконъюгированные с пероксидазой (GAR-HRP) и козьи антитела, полученные против иммуноглобулинов мыши, сконъюгированные с пероксидазой (GAM-HRP) (Sigma).

Реакция убиквитилирования in vitro Реакционная смесь содержала по 5 µM рекомбинантных белков Ubc13 и Mms2, 70-190 nM E1, по 10 mM АТФ и дитиотреитола, 10 mM MgCl, 50 mM NaCl, 25 mM TrisHCl (pH 7,5) и убиквитин в концентрации 0,5 мг/мл. Реакция проводилась при 30оС в течение 1-12 часов, остановка инкубации осуществлялась добавлением эквивалентного объема 2Х буфера Лэммли и нагреванием до 65оС в течении минут.

Так как в эксперименте использовались рекомбинантные варианты белка Ubc13, слитые с остатком глутатион-S-трансферазы (GST), перед массспектрометрическими исследованиями проводилось отщепление GST тромбином (Novagen) в соответствии с рекомендациями производителя.

Культивирование клеточных линий Клетки эпидермоидной карциномы человека А431, а также клетки, полученные на основе фибробластов мыши линии NIH 3Т3 и экспрессирующие нормальные или мутантные формы рецептора ЭФР человека (HER14, CD165, CD123, CD63 и К721R), были получены из Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН). Клетки культивировались в чашках Петри с использованием среды Игла, модифицированной Дюльбекко (DMEM), содержащей 10% (v/v) эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (PAA). Инкубация проводилась 2-3 суток при 37оС в атмосфере 5%-ного СО Перед проведением 2.

опыта клетки переводились на обедненную среду, содержащую около 0,1% сыворотки.

Стимуляция эндоцитоза с предварительным связыванием лиганда Монослойные культуры клеток инкубировали в рабочей среде DMEM, содержащей 0,1% БСА (Sigma) и 20 мМ HEPES (pH 7,4) при 40С в течение мин в присутствии ЭФР в концентрации от 20 до 100 нг/мл. После отмывки несвязавшегося эпидермального фактора роста эндоцитоз стимулировали переводом клеток в рабочую среду, не содержащую лиганда, при температуре 370С на определенное время. По окончании инкубационного периода клетки помещали на лед, среду удаляли.

Иммунопреципитация Клетки лизировали в буфере, содержащем 1% (w/v) Тритона Х-100, 0,5% (w/v) NP40, 150 mM NaCl, 10 mM NaF, 1 mM PMSF, 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 1 mM ортованадата натрия, 1 mM N-этилмалеимида и 1:500 коктейля ингибиторов протеаз (Sigma). Концентрацию белка измеряли по методу Лоури (Lowry et al., 1951).

Параллельные пробы уравнивались по концентрации белка. Инкубацию с антителами проводили при 40С 10-12 часов при перемешивании. Затем добавляли сефарозу, конъюгированную с A/G-белком, по 10 мкл на пробу, и инкубировали еще 4 часа при тех же условиях. После отмывки 3 раза на льду лизисным буфером к сефарозе добавляли 2-кратный раствор буфера Лэммли и кипятили 2 раза по минут, центрифугировали 1 минуту на 12000 об./мин, отобранный буфер в дальнейшем использовали для электрофореза.

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»