WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

Фомина Наталья Константиновна ДЕЙСТВИЕ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ И ПЕПТИДНОГО БИОРЕГУЛЯТОРА ЭПИТАЛОНА НА КИНЕТИКУ РОСТА И ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ МОРФОЛОГИЮ САРКОМЫ М-1 03.00.01 - радиобиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Обнинск – 2007 2

Работа выполнена в лаборатории радиационной патоморфологии ГУ - Медицинский радиологический научный центр Российской академии медицинских наук

Научный консультант: кандидат медицинских наук Южаков Вадим Васильевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук Курпешев Оразахмет Керимбаевич доктор биологических наук Спирин Евгений Викторович

Ведущая организация: ГУ – Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН

Защита состоится 25 сентября 2007 г. в 1100 часов на заседании диссертационного совета Д 001.011.01 в ГУ - Медицинский радиологический научный центр РАМН (249036, г. Обнинск, ул. Королева, д. 4)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ - Медицинский радиологический научный центр РАМН.

Автореферат разослан «_» _ 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Палыга Г.Ф.

3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Одной из актуальных задач современной радиобиологии и онкологии является поиск оптимальных методов лечения злокачественных новообразований, оценка эффективности их действия и изучение механизмов индивидуальной чувствительности опухолей к лечебным воздействиям.

До настоящего времени одним из основных способов лечения в онкологии остается лучевая терапия. Главной задачей лучевой терапии является уничтожение максимального числа опухолевых клеток при наименьшем поражении окружающих нормальных тканей [Ярмоненко С.П., Вайнсон А.А., 2004]. Несмотря на совершенствование методов лучевой терапии и достижения в области онкологической радиобиологии, прогнозировать реакцию опухолей на радиационное воздействие достаточно сложно. Особое внимание уделяется возможностям применения в лучевой терапии радиомодифицирующих веществ, способных повышать эффективность радиационного воздействия на злокачественные опухоли до, во время и после облучения.

Одним из перспективных современных направлений является биотерапия опухолей с применением регуляторных пептидов [Анисимов В.Н., Хавинсон В.Х.,1993; Хавинсон В.Х., Анисимов В.Н., 2003]. Ранее полученные нами данные об ингибирующем действии синтетического биорегулятора эпиталона на пролиферативную активность клеток свидетельствуют о целесообразности испытания этого пептида в качестве потенциального противоопухолевого препарата [Хавинсон В.Х. и др., 2001].

Благодаря открытиям в области клеточной и молекулярной биологии злокачественного роста появилась возможность применения в радиобиологических исследованиях различных маркеров, отражающих пролиферативную активность, функциональное состояние и гибель опухолевых клеток. Применение этих чувствительных методов требует стандартизации количественной оценки морфофункциональных показателей для анализа кинетических параметров ответа новообразований на облучение при разработке схем лучевой и комбинированной терапии на экспериментальных моделях опухолевого роста.

В последние годы важный аргументированный блок для описания биологических явлений на количественном уровне, являющийся необходимой предпосылкой для математических моделей динамических структур и процессов в клетке, обеспечивает компьютерный анализ изображений.

Цель и задачи исследования Целью данного диссертационного исследования является изучение структурно-функциональных особенностей экспериментальной опухоли саркомы М-1 при радиационном повреждении и введении синтетического пептида – эпиталона с использованием компьютерного анализа микроскопических изображений.

В соответствии с указанной целью были сформулированы и последовательно решены следующие задачи:

1. Изучить параметры кинетики роста саркомы М-1 на фоне действия гамма-облучения, при введении эпиталона и при их сочетанном воздействии.

2. Исследовать основные закономерности действия гамма-излучения и эпиталона на морфо-функциональные характеристики саркомы М-1.

3. По критериям пролиферативной активности и индуцированной гибели опухолевых клеток оценить возможность применения эпиталона в комплексных методах терапии злокачественных новообразований.

Научная новизна работы Впервые по материалам морфо-функциональных исследований, основанных на применении высокочувствительных методов гистохимии, иммуногистохимии и морфометрии, создана количественная база данных для быстрорастущей соединительно-тканной опухоли саркомы М-1.

На основе данных компьютерного анализа в периферической зоне, определяющей рост опухолей, рассчитана фракция пролиферирующих клеток по индексу PCNA и уровень спонтанной гибели по индексу апоптоза, а также изучены параметры пролиферативной активности и индуцированной гибели опухолевых клеток при действии ионизирующего излучения, синтетического пептида – эпиталона и их сочетанном применении.

Установлено, что пептидный биорегулятор «эпиталон» замедляет рост саркомы М-1, а морфологическим эквивалентом ингибирующего действия препарата является развитие некроза опухолей и усиление апоптотической гибели опухолевых клеток. Согласно результатам проведенных исследований, по механизму действия, эпиталон можно отнести к классу модификаторов биологических реакций, а его основной эффект, по-видимому, реализуется через сосудистое русло опухолей.

Практическая значимость работы Полученные результаты позволили выяснить особенности действия ионизирующего излучения и пептидного препарата на радиорезистентную опухоль саркому М-1. Эти сведения свидетельствуют о противоопухолевой активности эпиталона, что открывает возможность его применения в комплексных методах противоопухолевой терапии.

Метод количественной оценки морфо-функциональных параметров экспериментальной опухоли саркомы М-1 показал принципиальную возможность его использования в комплексном исследовании радиорезистентных опухолей для объективизации диагностики и разработки критериев прогноза. Новые данные о действии гамма-излучения и пептидного биомодулятора на клеточное микроокружение, пролиферативную активность и апоптоз клеток саркомы М-1 могут быть использованы как базовые для дальнейших экспериментальных исследований.

Результаты исследований показали, что автоматизированные методы компьютерного анализа изображений позволяют стандартизировать количественную оценку экспрессии маркеров, используемых в онкорадиобиологии, и расширяют возможность получения объективных данных, необходимых для оценки дисбаланса между процессами пролиферации и индуцированной гибели при разработке схем лучевой и комбинированной терапии на экспериментальных моделях опухолевого роста.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Компьютерный анализ микроскопических изображений позволил установить основные закономерности действия гамма-облучения и синтетического пептида «эпиталона» на функциональную морфологию саркомы М-1.

2. Радиационно-индуцированный апоптоз является важным фактором, который обеспечивает результативность действия гамма-облучения на радиорезистентную форму экспериментальной опухоли – саркому М-1.

3. Пептид «эпиталон» достоверно замедляет рост саркомы М-1. Вместе с тем, на фоне деструктивных изменений в паренхиме опухолей, вызванных гамма-облучением, значимый аддитивный онкомодифицирующий эффект эпиталона не регистрируется.

Апробация и реализация результатов исследования Основные результаты и положения диссертационной работы доложены и обсуждены на: V Всероссийском съезде онкологов (Казань, 2000); IV съезде по радиационным исследованиям (Москва, 2001); международной междисциплинарной конференции «Новые биокибернетические и телемедицинские технологии 21 века для диагностики и лечения заболеваний человека» («НБИТТ-21») (Петрозаводск, 2002); Международном экологическом форуме «Окружающая среда и человек» (Санкт-Петербург, 2003);

Всероссийской конференции «Радиобиологические основы лучевой терапии» (Москва, 2005). Результаты диссертации используются в научно-практической работе ГУ МРНЦ РАМН.

Диссертация апробирована на научной конференции экспериментального радиологического сектора ГУ МРНЦ РАМН 7.03.2007 г. (протокол № 223).

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Текст диссертации изложен на 162 страницах, включающих 47 рисунков и 2 таблицы. Список литературы содержит 281 источник, из них отечественных —96, зарубежных — 185.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования Работа выполнена на 90 самцах белых беспородных крыс в возрасте 3-х мес, имеющих массу тела 180 - 200 г. В качестве объекта исследования использовали перевиваемый штамм саркомы М-1. На 11 сут после перевивки животных с опухолевыми узлами правильной формы были распределены на группы по 15 крыс: 1 - контроль; 2 - -облучение опухолей в дозе 30 Гр; 3 - введение эпиталона; 4 - -облучение опухолей в дозе 30 Гр + введение эпиталона. Животные с «нестандартными» опухолями были дополнительно включены в 1 и 2 группы для изучения особенностей гистоархитектоники саркомы М-1 в экспоненциальной фазе роста и определения степени лучевой инактивации опухолевых клеток через 3 ч, 1 и 3 сут после -облучения.

Размеры опухолей определяли 2-3 раза в неделю и рассчитывали их объем по формуле эллипсоида. Коэффициент роста опухолей определяли по формуле КРО = (Vt35– Vt16)/Vt16, где Vt35 и Vt16 – объемы опухолей на 35 и 16 сут после имплантации.

Местное однократное -облучение опухолей животных 2-й и 4-й групп выполнено на кобальтовой установке «Луч» при мощности дозы 0,8 Гр/мин.

Облучение проведено на 16 сут роста опухолей. Острые ЛРК над опухолью оценивали на 10 сут после -облучения по упрощенной системе баллов. На сут роста саркомы животным 3-й и 4-й групп начали вводить эпиталон. К этому сроку средний объем опухолей в контрольной группе достиг 1 см3. Препарат вводили внутрибрюшинно по 0,5 мкг на животное семь дней подряд.

По динамике и дивергенции линий роста опухолей в испытуемых группах был определен срок для гистологического изучения саркомы. На 26 сут роста опухолей (10 сут после -облучения во 2-й и 4-й группах; 2 сут после окончания введения эпиталона в 3-й и 4-й группах) в каждой группе было отобрано по крыс. Выведение животных из опыта и выделение опухолей проведено под нембуталовым наркозом (50 мг/кг). Кусочки опухолей фиксировали 24 ч кислой жидкостью Буэна для светомикроскопических исследований и по Карновскому для электронной микроскопии. Обезвоженный материал заливали, соответственно, в парапласт и эпон.

Микротомные срезы толщиной 7 мкм помещали на предметные стекла, покрытые пленкой из поли-L-лизина (Sigma). Общую гистологию саркомы изучали на срезах, окрашенных гематоксилином и эозином и по Ван-Гизон.

Тучные клетки селективно окрашивали 1% раствором толуидинового синего (Fluka) в 0,5 М HCl при рН 0,5 [Enerback L. et al., 1986]. Ультраструктурные исследования проводили в электронном микроскопе JEM-100S (JEOL) на ультратонких срезах, контрастированных уранилацетатом и цитратом свинца.

Тип клеток идентифицировали способом серийных полутонких - ультратонких срезов. Полутонкие срезы окрашивали по методу Humphrey, Pittman (1974).

Иммуногистохимические исследования проводили с использованием мышиных моноклональных антител к PCNA (1:50, Calbiochem), серотонину (1:15, DAKO) и АБП набора для выявления мышиных иммуноглобулинов (Vectastain). Адгезионную связь клеток саркомы с базальной мембраной эндотелия сосудов и их способность к локальной инвазии изучали с помощью кроличьих антител к ламинину и БСП комплекса для кроличьих иммуноглобулинов (Sigma). Для изучения перифокального иммунного ответа применяли набор для выявления крысиных иммуноглобулинов (BioGenex).

Функциональную активность опухолевых клеток изучали методом импрегнации ядрышковых организаторов в модификации [Мамаев Н.Н. и др., 1984]. Апоптотические клетки визуализировали на препаратах, импрегнированных по методу Мозера [Moser B. A., 1995].

Морфометрические исследования выполнены с помощью системы компьютерного анализа микроскопических изображений IMSTAR (Франция) с применением прикладных компьютерных лицензионных программ Morphostar2 и Colquant-2. Для каждого животного подсчет соответствующих структур проводили в 10-20 визуальных тестовых полях по трем срезам каждой исследуемой опухоли. Ат для ядер опухолевых клеток и определения индекса PCNA составляла 0,5 мм2 и включала не менее 2000 опухолевых клеток в препаратах контрольной группы. Ат для AgNOR = 0,3 мм2 и включала не менее 1000 ядрышковых организаторов. Индекс апоптоза и митотический индекс подсчитывали в 60 полях при иммерсионном увеличении микроскопа. Общая тестируемая площадь включала не менее 1000 ядер опухолевых клеток.

Параметры роста опухолей определяли по 10 животным. В 1-й и 3-й группах опухоли измеряли до гибели всех крыс; во 2-й и 4-й - на протяжении недель. Для изучения скорости прироста опухолей за определенный период n времени вычисляли среднюю геометрическую G(t1-tn) = V (t1) *V (t2)*...V (tn) в интервале времени t1-tn Скорость роста опухолей определяли по коэффициенту из уравнений линий тренда Vt = V0 + t.

Для статистической обработки полученных результатов использовали tтест Стьюдента для малых выборок и непараметрический U-критерий МаннУитни.

Результаты исследования и обсуждение По нашим данным, для саркомы М-1 характерна выраженная зональная неоднородность количественной плотности опухолевых клеток, их пролиферативной активности по PCNA и апоптотической гибели. Так, в участках солидного строения содержание апоптотических структур заметно выше, а интенсивность иммуноокрашивания ядер клеток саркомы на PCNA почти на 20% ниже по сравнению с опухолевыми клетками, которые располагаются в зоне роста новообразований и группируются вокруг отдельных сосудов. По-видимому, апоптотическая гибель клеток саркомы М-1 и синтез ядерного антигена пролиферирующих клеток достаточно чувствительны к концентрации поступающего в клетки кислорода, т.е. к гипоксии.

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»