WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Если с ферментом связываются более одной молекулы субстрата, то последующее каталитическое превращение АК улучшается. Количество связавшихся молекул, ингибирующих фермент, зависит от рН.

Следует отметить, что при окислении медленно окисляемых субстратов, таких как аскорбиновая кислота, в механизме действия пероксидазы заложен сложный регуляторный механизм, имеющий биологическое значение. Константа связывания АК с окисленными формами пероксидазы соизмерима с Кm быстро окисляемых органических субстратов фермента, поэтому предварительное связывание АК с полуокисленными формами пероксидазы (Е1 и Е2) может препятствовать их пероксидазному окислению. При связывании двух молекул АК процесс пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты будет ускоряться, а избыток АК понижает каталитическую активность фермента. Повидимому, данный регуляторный механизм обеспечивает выполнение избирательной антиоксидантной функции пероксидазы в растениях.

V, мкмоль/мин -4,0 -3,lg[AK] Рис. 6. Ингибирование реакции пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты ее избытком. Штриховая линия является теоретической при условии образования неактивного фермент-субстратного комплекса. рН 5.5, 0.1 М натрий-ацетатный буфер; пероксидаза – 0.мкМ; перекись водорода – 0.64 мМ; аскорбиновая кислота – 22.0-352.0 мкМ.

2.1.2. Гидрохинон – быстро окисляемый субстрат пероксидазы.

Реакция пероксидазного окисления гидрохинона характеризуется высокими kcat (12202225 c-1), что позволяет отнести этот субстрат к группе быстро окисляемых субстратов пероксидазы, таких как о-дианизидин, у которого kcat при рН 3.7-7.0 составляет 625-3540 c-(Лебедева и др., 1977). Величина Km для гидрохинона достаточно низкая и составляет 150650 мкМ в зависимости от рН, что по величине соизмерима с константой Михаэлиса для ферроцианида калия (Угарова и др., 1977). Однако это в 10 раз хуже, чем Km у одианизидина. Km и kcat пероксидазного окисления гидрохинона мало зависят от рН. Оптимум каталитической активности фермента приходится на рН 4.5-5.5. Связывание 2-3 молекул субстрата с фермент-субстратным комплексом ингибирует пероксидазу. Количество молекул гидрохинона, ингибирующих фермент, зависит от рН, что возможно, вызвано изменениями в Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 617 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2001/054.pdf протяженности субстратсвязывающего участка активного центра фермента, уменьшающегося в кислых рН.

2.2 Пероксидаза в реакциях совместного окисления аскорбиновой кислоты и гидрохинона Нами изучено совместное окисление аскорбиновой кислоты и гидрохинона (рис. 7).

Показано, что в этих реакциях осуществляется упорядоченный процесс окисления субстратов, который определяет преимущественное окисление медленно окисляемого субстрата. Предварительное связывание АК в активном центре фермента улучшает в 28-раз последующее связывание молекул гидрохинона. Связавшись, гидрохинон не оказывает влияние на связывание второй молекулы АК, что выражается в неконкурентном типе активирования.

--, мин М V --, М АК Рис. 7. Зависимости обратных начальных скоростей пероксидазного окисления АК при различных концентрациях гидрохинона, мкМ: 1-0, 2-2.0, 3-8.0, 4-12.0. Концентрации:

пероксидаза-94 нМ, перекись водорода-0.64 мМ, АК-2.2-176 мкМ, рН 5.5.

Очередность задается тем, что связывание АК с окисленными формами пероксидазы почти на два порядка лучше, чем гидрохинона. Присутствие гидрохинона в активном центре фермента способствует ускорению окисления молекул АК в 4-41 раз. Особенно этот эффект проявляется при рН 5.5-7.0. Оптимум активирования приходится на рН 6-7. Высокие концентрации АК ингибируют фермент как в реакциях индивидуального, так и совместного с гидрохиноном пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты. Причем, если в реакциях индивидуального окисления АК, фермент при рН 6-7 ингибируют 6-9 молекул субстрата, то в реакциях совместного окисления АК и гидрохинона ингибирование пероксидазы возможно лишь двумя молекулами аскорбиновой кислоты.

Пероксидаза хрена способна катализировать окисление органических соединений не только перекисью водорода, но в отдельных случаях и кислородом воздуха (Березин и др., 1975). Высказывается предположение, что для выполнения столь разнообразных функций у фермента имеется два различных активных центра (Рамазанова и др., 1971; Siegel, Galston, 1967). В некоторых реакциях для проявления каталитической активности пероксидазе требуются ионы металлов, такие как Mn2+, Zn2+, Cu2+, Ca2+ и др. или сложные органические соединения, вступающие во временное взаимодействие с ферментом. Проявление ответной реакции пероксидазы на различные соединения, которые могут активировать или ингибировать фермент позволяет отнести его к числу регуляторных (Андреева,1988).

Поэтому активирование пероксидазы в реакциях индивидуального и совместного пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты высокими концентрациями субстрата и Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 618 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2001/054.pdf гидрохинона позволяет предположить наличие вблизи активного центра фермента регуляторного участка, связывание с которым субстратов может повышать или понижать его активность.

Следует особо подчеркнуть биологическое значение наблюдаемого эффекта активации пероксидазы в реакциях окисления медленно окисляемого субстрата в присутствии быстро окисляемого и ингибирование активности фермента высокими концентрациями субстрата.

Выявленные закономерности позволяют понять механизм действия большого количества соединений, используемых в предпосевной обработке семян и обладающих стимулирующим, ретардантным, ингибирующим действием в отдельности, а также в различных сочетаниях (Михно,1997). Пероксидаза входит в состав комплекса ферментов катализирующих окисление различных соединений, используемых в аэробных метаболических процессах, интенсивность которых возрастает в процессе набухания и прорастания семян (Gibson, Liu, 1978).

До сих пор являются спорными вопросы относительно эффектов активирования всхожести семян низкими концентрациями соединений и механизмы понижения их всхожести при использовании высоких концентраций веществ. На основании полученных данных можно предложить механизм участия пероксидазы в этих процессах. Так как фермент является показателем протекания аэробных метаболических процессов в семенах и активность которого увеличивается при их прорастании, понижение активности пероксидазы служит критерием углубления покоя семян. Поэтому аскорбиновая кислота и гидрохинон в высоких концентрациях, понижая активность пероксидазы, могут способствовать переключению аэробных метаболических процессов на анаэробные, что будет проявляться в углублении покоя семян и понижении всхожести. Тогда как низкие концентрации субстратов пероксидазы при их совместном присутствии способны активировать фермент, увеличивая скорость протекания аэробных метаболических процессов, обеспечивая переход семян из покоя в активное состояние, увеличивая их энергию прорастания и всхожесть.

2.3. Роль низкомолекулярных антиоксидантов в регулировании активности пероксидазы Нами изучено участие антиоксидантов: дигоксина, кверцетина и аскорбиновой кислоты в пероксидазном окислении о-дианизидина. Показано, что кверцетин и аскорбиновая кислота реагируют с окисленными соединениями пероксидазы. При добавлении дигоксина при всех изученных концентрациях мы не наблюдали изменений оптической плотности на полосе Соре (403 нм), что свидетельствует о том, что дигоксин не является субстратом пероксидазы. Однако дигоксин проявлял антиконкурентный характер ингибирования пероксидазы в реакциях индивидуального и совместного с ферроцианидом окисления одианизидина при всех изученных значениях рН. Дигоксин может связываться с ферментсубстратным комплексом как в реакциях индивидуального окисления о-дианизидина, так и в реакциях его совместного окисления с ферроцианидом калия. Сродство ингибитора к фермент-субстратному комплексу при совместном окислении в 5-6 раз выше, чем в реакции индивидуального окисления о-дианизидина и зависело от рН.

Кверцетин, который по своей природе является субстратом пероксидазы (Жанаева и др., 1986), ингибировал фермент в реакции пероксидазного окисления о-дианизидином по смешанному типу. Связываясь в активном центре фермента, кверцетин затруднял последующее связывание и превращение о-дианизидина. Смешанный тип ингибирования вызван конкуренцией двух субстратов пероксидазы, один из которых является медленно окисляемым (кверцетин), а другой быстро окисляемым (о-дианизидин).

При совместном внесении в реакционную среду АК и о-дианизидина наблюдалось их дифференцированное пероксидазное окисление - окисление ОДН не происходило до полного превращения аскорбиновой кислоты. В отсутствие пероксидазы о-дианизидин не ускорял окисление аскорбиновой кислоты. При использовании низких концентраций пероксидазы (0.17 нМ) окисление аскорбиновой кислоты протекает очень медленно, что Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 619 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2001/054.pdf свидетельствует об активации пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты одианизидином. Начальная скорость окисления АК не зависела от ее концентрации в интервале (4-320 мкМ), но изменялась при концентрации о-дианизидина (17-172 мкМ) в соответствии с уравнением Михаэлиса-Ментен. По-видимому, как и при совместном окислении ферроцианида и о-дианизидина (Ugarova et al., 1981), в данном случае наблюдается субстрат-субстратная активация. Скорость пероксидазного окисления АК возрастает в 200-700 раз в присутствии о-дианизидина. Медленно окисляемый субстрат, каким является аскорбиновая кислота, эффективнее окисляется радикалами быстро окисляемого субстрата о-дианизидина, чем соединениями Е1 и Е2 пероксидазы. Показано, что как при индивидуальном, так и совместном с о-дианизидином окислении аскорбиновой кислоты на рН-зависимости lgkcat проявляется ионогенная группа с рКа6.5. Можно высказать предположение, что это имидазольная группа остатка гистидина (Jamada, Jamasaki, 1974; Лебедева и др., 1977).

Выявленные закономерности имеют важное биологическое значение, поскольку раскрывает регуляторную роль антиоксидантов в пероксидазном окислении быстро окисляемых субстратов, заключающаяся в том, что увеличение содержание антиоксидантов в исследуемом биообъекте может ингибировать пероксидазу, тогда как возрастание содержания пероксидазы будет способствовать быстрому их окислению.

3. Влияние низкомолекулярных антиоксидантов на всхожесть семян пшеницы 3.1. Действие физико-химических факторов на прорастание семян Биологически активные вещества очень часто используются для повышения всхожести семян (Шорнинг и др.,1999; Лукаткин, Левина, 1997). В зависимости от природы они могут регулировать протекание метаболических процессов (Ладыженская, Кораблева, 1985), активировать или ингибировать различные ферменты (Кефели, 1997), влиять на проницаемость мембран клеток (Сытник, Терещенко, 1983). Среди этой группы следует выделить соединения, обладающие антиоксидантной активностью, и являющиеся субстратами пероксидазы. Обладая разным механизмом действия, они в малых концентрациях активировали прорастание семян, а в больших - понижали их всхожесть. При этом проявлялась индивидуальная чувствительность семян пшеницы к используемым соединениям. Низкие концентрации строфантина, аскорбиновой кислоты, норадреналина, салицилата натрия, аминазина и этанола повышали всхожесть семян пшеницы на 15-20%.

Тогда как высокие концентрации исследуемых соединений понижали их всхожесть. По величине ингибирующего эффекта исследованные нами соединения можно было расположить в следующем порядке: 2,4 ДНФ > гидрохинон >аминазин >дигоксин >салицилат натрия > этанол > норадреналин > строфантин >викасол.

Установлено, что высокие концентрации этанола понижают всхожесть семян пшеницы (Андрианова, Бакулидзе, 1996), тогда как малые дозы УФ облучения могут повышать их всхожесть (Рогожин, Курилюк, 1996). Известно, что свет может усиливать чувствительность растений к низким температурам. Так, например, выращивание растений при 10-13°С и высокой радиации способствует появлению некротических пятен на листьях и приводит к снижению интенсивности фотосинтеза при стабильном содержании хлорофилла (Taylor, Rowley, 1971; Scott, 1970). Нами изучено влияние 5 и 60 мин УФ-излучения на всхожесть семян пшеницы сорта Омская 12. Показано, что у семян, предварительно подвергнутых УФоблучению, всхожесть несколько понижается, тогда как УФ-облучение семян после замачивания в растворах этанола различных концентраций повышает их всхожесть на 1215%. Причем это особенно проявляется при длительном в течение 60 мин УФ-облучении семян. Проращивание семян при низкой температуре (14°С) стимулирует их прорастание, понижая ингибирующий эффект этанола. УФ-облучение таких семян дополнительно может увеличивать их всхожесть.

Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 620 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2001/054.pdf Исходная влажность семян обычно составляет 5-6%. При погружении в воду в течение 16-24 часов идет активное поглощение воды семенами. В этот период запускаются основные биохимические процессы, обеспечивающие последующее прорастание семян, на протекание которых оказывают влияние биологически активные соединения. Поэтому этот отрезок времени является наиболее важным в проявлении специфичности действия функциональных веществ. Показано, что всхожесть семян пшеницы имеет выраженный колебательный характер, зависящий от природы и концентрации используемого вещества. Так, малые концентрации этанола (0.1-0.5 мМ), в которых проводили набухание семян в течение первых 24 часов, повышали всхожесть семян пшеницы, а высокие концентрации этанола (0.1-2 М) понижали их всхожесть. Особенно это заметно, если замачивание семян проводили в течение первых 4-8 часов. Аналогичный эффект был отмечен и в работе (Зауралов и др., 1997).

Однако это влияние этанола зависело от температуры среды и продолжительности замачивания.

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»