WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

В таблицах приведены средние значения и их стандартные ошибки, полученные из 4-х отдельных опытов, каждый из которых состоял из четырех повторностей (чашек Петри), статистическую ошибку для средней проводили по методике (Лакин, 1990), используя ППП Снедекор V2.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Состояние антиоксидантной системы при прорастании семян пшеницы 1.1 Активность пероксидазы и содержание низкомолекулярных антиоксидантов при набухании семян пшеницы Наличие высокой активности пероксидазы в семенах и проростках пшеницы позволяет предположить об участии фермента в метаболических процессах, происходящих во время покоя семян и в период их активного прорастания. Нами изучена динамика активности пероксидазы и содержание АО в семенах пшеницы в течение 24 часов набухания при 50 (I группа) и 230C (II группа). Процесс набухания семян, замоченных в дистиллированной воде, сопровождается возрастанием активности фермента (рис. 1).

3,2,4 8 12 16 20 Время, ч Рис. 1. Активность пероксидазы зерен пшеницы сорта Омская 12 в зависимости от времени набухания при 50С (1) и 230С (2).

Определены величины каталитических констант пероксидазы зерен пшеницы в реакциях пероксидазного окисления о-дианизидина и аскорбиновой кислоты. Показано, что Km мало изменяется в исследованном диапазоне рН 5-7. Km по о-дианизидину незначительно отличается от константы Михаэлиса, определенной для очищенного препарата пероксидазы хрена фирмы “Reanal”, тогда как Km по АК в 5-9 раз ниже показателей очищенного препарата. Такие различия можно объяснить присутствием в гомогенате посторонних субстратов пероксидазы, участвующих в совместном окислении аскорбиновой кислоты.

V, мкмоль/мин г сухой массы Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 611 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2001/054.pdf Активность пероксидазы и содержание АО в зародыше у семян I группы было выше в 1.раза. У этих же семян в процессе набухания повышается активность пероксидазы в эндосперме и кожуре в 1.5 и 1.8 раза соответственно (табл. 1). Пероксидаза входит в состав антиоксидантной системы, активность которой определяет уровень устойчивости растений к различным воздействующим факторам в процессе онтогенеза. Фермент может проявлять свойства оксидазы. Поэтому активность пероксидазы возрастает с увеличением дыхания семян при выходе их из состояния вынужденного покоя.

Таблица 1.Биохимические показатели органов семян пшеницы сорта Омская 12 после часов замачивания зерен в дистиллированной воде при разных температурах.

Орган ПО мкмоль/мин г сухой ПОЛ нмоль/ г сухой АО мкг/г сухой массы массы массы Температура, 0С 5 23 5 23 5 Сухое зерно 3.70±0.21 3.60±0.25 25.3±1.8 21.8±1.1 85.2±3.2 88.3±3.Кожура 0.44±0.03 0.25±0.02 23.4±1.5 25.5±1.6 160.7±12.1 176.2±13.семени Эндосперм 0.42±0.03 0.28±0.03 19.6±1.2 20.7±1.3 133.3±6.5 124.3±11.Щиток -22.2±0.12 21.7±0.11 256.4±15.2 256.4±18.Зародыш 59,3±0.45 39.0±0.32 95.3±5.4 117.4±8.5 398.4±24.7 285.7±21.1.2 Активность пероксидазы и содержание низкомолекулярных антиоксидантов при прорастании семян пшеницы Активность пероксидазы в проростках пшеницы, семена которых замачивали при 50 и 230С, проявлялась в своеобразной динамике и зависела от природы исследуемых частей пшеницы (зерно, надземная часть или корни) (рис. 2). Отмечался линейный рост активности пероксидазы в зерне с небольшим опережением у зерен II группы (рис. 2а). Зависимости активности пероксидазы надземной части проростков пшеницы имели вид “качелей” с постепенным снижением в первые 3-4 дня, а затем повышением к 7-му дню прорастания проростков (рис. 2б). Причем более высокие показатели активности пероксидазы были у семян II группы. Своеобразная динамика проявлялась в активности пероксидазы корней (рис. 2в).

В корнях семян II группы в первые 2-3 дня понижалась активность пероксидазы и только на 7-ой день отмечался рост. Зависимость активности пероксидазы у корней семян I группы принимала вид затухающих колебаний с возрастанием активности на 3-й и 6-й день, с понижением к седьмому дню прорастания корней до нормы. Причем активность пероксидазы в корнях семян I группы была в 1.5-2.5 раза выше, чем у корней семян II группы. Нами отдельными экспериментами было показано отсутствие в супернатанте активаторов и ингибиторов пероксидазы. Поэтому мотивацией к повышению активности пероксидазы, по-видимому, является проявление компенсаторных антиоксидантных механизмов, направленных на предотвращение развития окислительного повреждения тканей (Бурлакова и др., 1975), вызванных воздействием низких температур.

Поскольку ключевую роль в развитии окислительного повреждения играют активные формы кислорода: О2-, Н2О2, НО, органические радикалы, образование которых наиболее интенсивно протекает в корнях растений (Минибаева и др., 1997). Увеличение активности пероксидазы может быть вызвано синтезом на холоде в семенах пшеницы новых изоферментов пероксидазы или накоплением соединений, являющихся субстратами фермента, индуцирующих её синтез, что будет проявляться в возрастании активности пероксидазы (Андреева,1988). Однако высокие концентрации субстратов пероксидазы могут Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 612 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2001/054.pdf ингибировать фермент, способствуя, таким образом, увеличению концентрации перекиси водорода в клетках.

А Б В 2 30 0 1 2 3 4 5 6 2 3 4 5 6 7 2 3 4 5 6 Время прорастания, сут.

Рис. 2. Динамика активности пероксидазы (мкмоль/мин г сухой массы) в зерне (А), надземной части (Б) и корнях (В) проростков пшеницы сорта Омская 12 в зависимости от их времени прорастания. Семена предварительно замачивали в дистиллированной воде при 50С (1) и 230С (2) в течение 24 ч, а проращивали при 230С.

Подтверждением высказанных предположений являются результаты по динамике содержания МДА и АО в корнях и надземной части проростков пшеницы зерен I и II групп (рис. 3). Видно, что показатели уровня ПОЛ и содержания АО находятся в прямой зависимости (r=0,5).

Повышение содержания АО преимущественно сопровождается повышением ПОЛ, тогда как активность пероксидазы возрастает с уменьшением содержания антиоксидантов (r=0,65). В случае увеличения содержания АО отмечается понижение активности пероксидазы, а увеличение активности пероксидазы сопровождается понижением уровня ПОЛ (r=-0,65).

АО мкг/г сухой массы МДА нмоль/г сухой массы 500 Б А В 200 Г 1 3 4 5 6 3 4 5 6 Время прорастания, сут.

Рис. 3. Влияние температуры замачивания семян пшеницы сорта Омская 12 на содержание малонового диальдегида и антиоксидантов в их надземной части (А, Б) и корнях (В, Г) этиолированных проростков. Условия те же, что на рис. 2.

Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 613 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2001/054.pdf Величины показателей корреляции, возможно, были выше, если бы при проведении анализа учитывалось влияние всех компонентов антиоксидантной системы (супероксиддисмутаза, каталаза и т д). Наблюдаемые изменения, возможно объяснить в рамках единого представления о роли пероксидазы и АО, являющихся компонентами антиоксидантной системы, в регулировании процессов перекисного окисления в живых организмах. Пероксидаза способна использовать в качестве субстратов антиоксиданты и перекись водорода. Фермент катализирует реакцию, в которой АО окисляются, а перекись водорода восстанавливается до воды. Однако в высоких концентрациях антиоксиданты способны ингибировать фермент и таким образом способствуют увеличению уровня ПОЛ в клетках. Взаимная регулируемость компонентов антиоксидантной системы позволяет контролировать ПОЛ в живых организмах и поддерживать его на определенном постоянном уровне.

1.2.1 Каталитические свойства пероксидазы проростков пшеницы Нами изучены каталитические параметры пероксидазы 7-ми суточных проростков пшеницы. В качестве субстратов использовали аскорбиновую кислоту (медленно окисляемый) и о-дианизидин (быстро окисляемый субстрат). Показано, что различия в величинах Km по ОДН пероксидазы проростков пшеницы (надземная часть и корни) (табл.

2), а также Vm проростков пшеницы семян I и II групп незначительны. Основные изменения наблюдаются у Km по АК пероксидазы корней пшеницы зерен I и II групп. Величины Km зерен I группы выше в 1.5-2 раза, по сравнению с зернами II группы. Значения Vm по ОДН и по АК пероксидазы корней пшеницы зерен I группы в 1.5-2 раза выше, чем корней пшеницы зерен II группы. Тогда как Km по АК пероксидазы корней пшеницы зерен II группы в 2-7 раз ниже, у пероксидазы надземной части проростков этой же группы. Следует отметить различия в показателях Km по ОДН корней пшеницы, которые были в 1.5-3 раза выше, чем у пероксидазы хрена. Так же можно отметить сильные различия в Km по АК для пероксидазы хрена, и из надземной части и корней проростков пшеницы. У корней пшеницы зерен I и II групп Km по АК в 3-13 и 6-19 раз ниже соответственно, чем у пероксидазы хрена.

Таблица 2. Величины Km (мкМ) реакций пероксидазного окисления о-дианизидина и аскорбиновой кислоты, катализируемых пероксидазой зерен и 7-ми суточных проростков (надземная часть и корни) пшеницы сорта Омская 12.

рН Сухое зерно Проростки пшеницы Корни хрена** Надземная часть Корни ОДН АК ОДН* ОДН АК ОДН* АК* ОДН АК ОДН АК 5.54±2 38±2 62±2 94±3 263±12 22±1 70±2 62±2 33±2 40±2 340±5.59±3 35±2 137±4 115±3 161±9 67±3 51±2 124±4 27±2 45±2 170±6.57±2 30±2 49±2 64±2 33±2 65±2 15±1 67±2 11±1 40±2 190±7.39±1 26±1 12±1 36±2 24±1 52±2 18±1 39±2 12±1 30±1 230±* зерна пшеницы замачивались при 5°С, ** пероксидаза хрена - препарат фирмы “Reanal”.

Такую высокую разницу в значениях Km можно объяснить, во-первых, за счет того, что в исследованиях были использованы гомогенаты корней пшеницы, содержащие весь спектр изоферментов пероксидазы. Тогда как пероксидаза хрена являлась очищенным препаратом, в составе которого преимущественно изоферменты С и В (Андреева, 1988). Во-вторых, наличием в гомогенате тканей большого количества антиоксидантов, являющихся субстратами пероксидазы, в присутствии которых скорость окисления ОДН и АК может возрастать (Лебедева, Угарова, 1996).

Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 614 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2001/054.pdf 1.3 Роль пероксидазы и низкомолекулярных антиоксидантов в защите проростков от окислительного стресса.

Поскольку пероксидаза и антиоксиданты входят в единую систему защиты растений от окислительного стресса, то нами изучено их участие в регулировании уровня ПОЛ на 3-день прорастания проростков пшеницы (рис. 4).

200 400 1 А Б 1' 2' 50 3' 0 200 3 4 5 3 4 Время прорастания, сут.

Рис. 4. Динамика содержания антиоксидантов (1,1’), активности пероксидазы (2,2’) и малонового диальдегида (3,3’) в надземной части (А) и корнях (Б) проростков пшеницы сорта Омская 12. Предварительно зерна пшеницы замачивали в дистиллированной воде при 50С в течение 24 ч, проращивание проводили при 280С.

Видно, что в надземной части проростков пшеницы уровень АО на 4-5 сутки понижается в 1.4-1.5 раза, при повышении активности пероксидазы в 1.8 раза. По-видимому, в этот период контроль за уровнем ПОЛ в побегах резко снижается, что проявляется в возрастании содержания МДА в 1.5 раза. В корнях проростков пшеницы на 4-й день прорастания уровень ПОЛ возрастает в 1.5 раза, при этом содержание АО и активность пероксидазы понижаются в 2.4 и 1.2 раза соответственно.

Таким образом, контроль над уровнем ПОЛ в проростках пшеницы осуществляют как низкомолекулярные антиоксиданты, так и пероксидаза. При этом известно, что в надземной части больше содержится АО и меньше пероксидазы, чем в корнях проростков пшеницы.

Поэтому ведущая роль в регулировании ПОЛ в надземной части преимущественно выполняют низкомолекулярные антиоксиданты, где за счет активного фотосинтеза идет их накопление. Тогда как в корнях эта функция возложена на пероксидазу, высокая активность которой обеспечивает поддержание определенного уровня ПОЛ. Поскольку высокие концентрации АО могут ингибировать пероксидазу, то, по-видимому, накопление или понижение содержания АО в проростках, может регулировать активность фермента.

Для подтверждения этого предположения мы изучили влияние низкой температуры (+5°С) во время 24 ч набухания зерен на динамику уровня ПОЛ, АО и активность пероксидазы проростков пшеницы в течение 3-5 суток прорастания. Как видно из рис. 5 в основном, наблюдаются взаимозависимые колебания исследованных параметров. При этом в корнях и надземной части понижение активности пероксидазы сопровождается возрастанием уровня ПОЛ, а повышение содержания АО приводит к понижению активности пероксидазы.

Понижение активности пероксидазы чаще всего наблюдается при повышении уровня АО, что можно объяснить ингибированием фермента высокими концентрациями антиоксидантов.

Содержание МДА, нмоль/г Активность ПО, мкмоль/мин г Содержание АО, мкг/г Содержание АО, мкг/г Активность ПО, мкмоль/мин г Содержание МДА, нмоль/г Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 615 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2001/054.pdf Б А 2 В Г 0 3 4 5 3 4 Время прорастания, сут.

Рис. 5. Динамика содержания малонового диальдегида (1), активность пероксидазы (2) и антиоксиданты (3) в корнях проростков пшеницы сорта Омская 12 в зависимости от времени проращивания, в % от контроля. Зерно замачивали при 50С, время, ч: А - 6, Б - 12, В - 18, Г 24. Проращивание семян проводили при 280С.

2. Низкомолекулярные антиоксиданты - субстраты пероксидазы 2.1 Пероксидаза в реакциях индивидуального окисления аскорбиновой кислоты и гидрохинона 2.1.1.Аскорбиновая кислота как медленно окисляемый субстрат пероксидазы Из данных приведенных в таблице 3 видно, что аскорбиновая кислота является медленно окисляемым субстратом пероксидазы. Пероксидазное окисление АК зависит от числа молекул субстрата взаимодействующих с окисленными формами фермента (Е1 и Е2). При связывании двух и более молекул АК наблюдается активирование фермента. Однако связывание нескольких (6-9) молекул АК ингибирует пероксидазу (рис.6).

Таблица 3. Величины каталитических констант для пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты pН Km1 Km2 kcat k’cat n мкМ мкМ c-1 c-4.0 - - -420±34 24.7±2.4.5 - - -380±28 20.2±2.5.0 9.7±0.4 340±31 2.1±0.12 17.6±1.5 18.6±1.5.5 10.8±0.5 170±12 1.9±0.11 6.8±0.3 4.5±0.6.0 6.1±0.3 190±10 1.1±0.11 8.4±0.9 12.4±0.6.5 - - -150±13 4.0±0.7.0 11.5±0.4 230±18 1.1±0.10 3.7±0.1 7.5±0.8.0 - - -97±7 3.8±0.Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 616 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2001/054.pdf Связывание одной молекулы АК с Е1 достаточно прочное, поскольку Кm1 составляет 6.111.5 мкМ, что соизмеримо с величинами констант связывания быстро окисляемого субстрата пероксидазы о-дианизидина, у которого Кm при рН 3.7-7.0 составляет 11-20 мкМ (Лебедева и др.,1977). Дополнительное связывание других молекул АК в 40-50 раз хуже.

Причем Кm связывания субстрата с окисленными формами фермента мало зависит от рН.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»