WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |
Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 605 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2001/054.pdf РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Сибирское отделение Сибирский институт физиологии и биохимии растений

На правах рукописи

УДК 577.1 ВЕРХОТУРОВ Василий Владимирович ВЗАИМНОЕ ВЛИЯНИЕ ПЕРОКСИДАЗЫ И НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ АНТИОКСИДАНТОВ ПРИ ПРОРАСТАНИИ СЕМЯН ПШЕНИЦЫ Специальность: 03.00.12 – Физиология растений 03.00.04 – Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск 1999 Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 606 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2001/054.pdf

Работа выполнена в лаборатории по исследованию биологически активных веществ Якутской государственной сельскохозяйственной академии

Научный консультант: кандидат химических наук, профессор, Рогожин. В. В.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, Романенко А. С.

доктор биологических наук, профессор, академик АН РС(Я) Кершенгольц Б. М.

Ведущая организация: Иркутский государственный университет им. А. А. Жданова

Защита диссертации состоится 8 декабря 1999 г в 1400 час. на заседании диссертационного совета Д.003.25.01. по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН по адресу:

664033 г. Иркутск, ул. Лермонтова 132 а/я 1243. СИФИБР

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН

Автореферат разослан 1999 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук: Акимова. Г. П.

Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 607 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2001/054.pdf

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Период прорастания семян делится на три этапа: 1) активация метаболизма (этап физического набухания семян); 2) подготовка к началу роста растяжением (наклевывание семян за счет перехода к растяжению клеток осевых органов зародыша); 3) собственно рост органов проростка (Обручева, Антипина, 1997). Во влажных семенах наблюдается активное потребление кислорода, который может вызывать окислительное повреждение тканей (Барабой, 1991). В развитии окислительного стресса играют роль активные формы кислорода: О21, О2-, Н2О2, НО, НОСl и др. (Зенков, Меньшиков, 1993). Накопление АФК в клетках приводит к нарушению протекания процессов транскрипции и репликации, изменяет состав липидов мембран. Супероксидные радикалы модифицируют белки (Дубинина, Шугалей, 1993), нарушают структуру ДНК, разрушают гормоны и другие функционально активные вещества (Владимиров, Арчаков, 1972). Поэтому изучение проявления компенсаторных механизмов в семенах на действие АФК является общебиологической задачей.

При прорастании семян в них генерируются активные формы кислорода, защита от которых осуществляется за счет использования высокоактивной антиоксидантной системы, состоящей из низко- и высокомолекулярных соединений (Inze, Van Montagu, 1995). К группе низкомолекулярных антиоксидантов относятся дигоксин, аскорбиновая кислота, гидрохинон, мочевая кислота, мелатонин, глутатион и др.(Кения и др., 1993). В комплекс высокомолекулярной системы антиоксидантной защиты входят ферменты: каталаза, супероксиддисмутаза, пероксидаза и др. (Андреева, 1988; Калашникова и др., 1999; Dhindsa et al., 1981). Действие компонентов системы антиоксидантной защиты в основном сводится к подавлению образования свободных радикалов, поддержанию нормального уровня свободнорадикальных процессов и перекисного окисления липидов в тканях (Бурлакова и др., 1975; Кения и др., 1993). Однако роль антиоксидантов в механизмах покоя и прорастания семян пшеницы мало изучена. Хотя известно, что многие из низкомолекулярных антиоксидантов могут быть субстратами пероксидазы (Андреева, 1988; Запрометов, 1993).

Являясь компонентами единой антиоксидантной системы растений, низко- и высокомолекулярные антиоксиданты способны оказывать взаимное влияние. Однако механизм этого взаимодействия недостаточно изучен.

Пероксидаза входит в состав антиоксидантной системы растений, активность которой определяет их уровень устойчивости к различным воздействующим факторам в процессе онтогенеза (Савич, 1989). Обладая широкой субстратной специфичностью, фермент может проявлять свойства оксидазы (Березин и др., 1975). Активность пероксидазы возрастает с увеличением дыхания семян при выходе их из состояния вынужденного покоя (Иванова, Вафина, 1997). Однако мало изучена роль пероксидазы в механизме действия антиоксидантной системы в процессе прорастания семян пшеницы и не раскрыта роль низкомолекулярных антиоксидантов в формировании механизмов покоя семян пшеницы.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в изучении роли антиоксидантной системы в процессе прорастания семян пшеницы, установлении закономерностей проявления ее реактивности на действие низких температур и биологически активных веществ, а также в раскрытии роли пероксидазы и антиоксидантов в механизмах формирования покоя семян пшеницы. В связи с этим необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить количественные закономерности проявления пероксидазной активности в процессе набухания и прорастания семян пшеницы.

2. Исследовать количественные показатели перекисного окисления липидов и антиоксидантов в проростках пшеницы.

3. Установить количественные закономерности проявления индивидуальной реактивности проростков на действие низких положительных температур.

4. Изучить влияние антиоксидантов на каталитические свойства пероксидазы в реакциях индивидуального и совместного окисления.

Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 608 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2001/054.pdf 5. Выявить закономерности взаимного влияния низко- и высокомолекулярных антиоксидантов, входящих в единую систему антиоксидантной защиты живых организмов.

6. Исследовать влияние экзогенных антиоксидантов на прорастание и всхожесть семян пшеницы.

Научная новизна. Пероксидазное окисление аскорбиновой кислоты осуществляется, если с окисленными формами пероксидазы (Е1 и Е2) связываются одна или две молекулы аскорбиновой кислоты. При связывании двух молекул субстрата наблюдается активирование фермента, тогда как связывание нескольких молекул субстрата ингибирует пероксидазу. При совместном присутствии аскорбиновая кислота и гидрохинон окисляются последовательно.

Гидрохинон активирует окисление аскорбиновой кислоты, тогда как её избыток ингибирует пероксидазу. Показано, что антиоксиданты и пероксидаза входят в единую систему антиоксидантной защиты растений, где выполняют строго специализированные функции.

Пероксидаза, являясь окислительно-восстановительным ферментом, контролирует уровень перекиси водорода и антиоксидантов в семенах и проростках пшеницы, а антиоксиданты, накапливаясь в тканях, участвуют в реакциях подавления образования свободных радикалов.

При этом антиоксиданты могут регулировать активность пероксидазы, осуществляя, таким образом, общий контроль над деятельностью системы антиоксидантной защиты.

Предложен механизм формирования покоя семян, заключающийся в том, что антиоксиданты в высоких концентрациях, понижая активность пероксидазы, могут способствовать переключению аэробных метаболических процессов на анаэробные, что будет проявляться в углублении покоя семян и понижении всхожести. Тогда как низкие концентрации субстратов пероксидазы при их совместном присутствии способны активировать фермент, увеличивая скорость протекания аэробных метаболических процессов, обеспечивая переход семян из покоя в активное состояние, увеличивая их энергию прорастания и всхожесть.

Практическая ценность. Установлено, что, насыщая зерна ксенобиотиками можно добиваться повышения их посевных качеств, а также сопротивляемости зерен и растений к экзогенным патогенным факторам. Полученные данные позволяют предложить наиболее оптимальное время замачивания семян в растворах функционально активных веществ, которое по результатам наших исследований приходится на первые четыре часа набухания.

Замачивание семян на это время не принесет им существенного вреда и не повлияет на посевные качества. Обработка семян пшеницы биологически активными веществами в течение первых двух часов будет способствовать повышению их всхожести. Полученные результаты могут быть рекомендованы для практического использования в сельскохозяйственном производстве для повышения сопротивляемости семян и проростков пшеницы к действию неблагоприятных факторов среды и увеличению их урожайности.

Защищаемые положения. Низкомолекулярные антиоксиданты способны регулировать активность пероксидазы, что проявляется в реакциях индивидуального и совместного окисления субстратов in vitro и in vivo. Взаимное влияние низкомолекулярных антиоксидантов и пероксидазы является одним из регуляторных механизмов прорастания семян пшеницы.

Апробация. Основные результаты диссертационной работы были доложены на совместном заседании кафедры агробиохимии и лаборатории исследования биологически активных веществ ЯГСХА (1997 г), на научно – практической конференции агротехнологического факультета секции “Физиология и биохимия растений” (Якутск г), на межвузовской конференции молодых ученых ЯГУ (1998 г), на семинаре отдела физиологии и биохимии Института биологии ЯФ СО РАН (1998 г), на семенаре Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН (1999 г.), на II-ой Международной конференции “Регуляторы роста и развития растений” (Москва 1999 г).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 199 страницах машинописного текста, Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 609 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2001/054.pdf состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа включает 12 схем, рисунков и 14 таблиц. Список литературы состоит из 265 источников, в том числе зарубежных авторов.

Список сокращений: АФК- активные формы кислорода; ПО – пероксидаза; ПОЛ перекисное окисление липидов; ТБК - тиобарбитуровая кислота; МДА - малоновый диальдегид; АО - антиоксиданты; ОДН - о-дианизидин; АК - аскорбиновая кислота; ГХ гидрохинон; 2,4-ДНФ - 2,4-динитрофенол; УФ-облучение - ультрафиолетовое облучение;

АДГ - алкогольдегидрогеназа; Г6ФДГ - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа; kcat, k’cat каталитические константы скорости реакции окисления одной и двух молекул АК соответственно; – численная константа; Vm - максимальная скорость; Km - константа Михаэлиса; Km1, Km2 - константы Михаэлиса при связывании одной и двух молекул АК соответственно; n - количество молекул АК, ингибирующих пероксидазу.

Материал и методы исследования В работе использовали НАД, НАДФ, глюкозо-6-фосфат, пероксидазу - фирмы “Reanal” (Венгрия), о-фенантролин - фирмы “Serva” (Германия), тритон Х-100 - препарат фирмы “Ferak Berlin” (Западный Берлин), этанол очищали перегонкой, о-дианизидин марки ч.

очищали возгонкой в вакууме, остальные реактивы соответствовали квалификации о.с.ч.;

для приготовления растворов использовали бидистиллированную воду.

Объектом исследования служили семена пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Омская 12. Для индукции перекисного окисления липидов семена с влажность 5-6% помещали под ртутнокварцевую лампу БНПО2-30-001У3.5, (Россия) с интенсивностью облучения Вт/м2, расположенной на расстоянии 25 см от семян. Контрольные и опытные (после УФоблучения) семена вначале замачивали на дистиллированной воде 24 ч, а затем проращивали на фильтровальной бумаге в чашках Петри при 23°С при естественном освещении, смачивая их дистиллированной водой (10 мл на чашку Петри). Число семян в одной чашке - 100.

Для анализа продуктов тиобарбитуровой кислоты и антиоксидантов 1 г семян или сырой массы проростков гомогенизировали в фарфоровой ступке с 3 мл 50%-ного раствора этанола, гомогенат центрифугировали 10 мин при 7000 g. Супернатант для исследования активности пероксидазы получали аналогично, используя 0.1 М натрий-фосфатный буфер рН 7.0.

Содержание малонового диальдегида исследовали по реакции с тиобарбитуровой кислотой при 532 нм, = 155 мМ-1см-1 (Владимиров, Арчаков, 1972) с нашими модификациями. К 0.5 мл супернатанта последовательно добавляли 0.5 мл 1%-ного раствора тритона Х-100, 0.2 мл 0.6 М НСl и 0.8 мл 0.06 М ТБК. Смесь нагревали на кипящей водяной бане 10 мин. Реакцию останавливали охлаждением при температуре 150С 30 мин. Для стабилизации окраски добавляли 0.2 мл 5 мМ трилона Б и 5-10 мл 96%-ного этанола.

Контролем служила пробирка, в которую добавляли те же растворы, кроме ТБК.

Содержание МДА в проростках выражали в нмоль/г сухой массы.

Анализ антиоксидантов проводили по методике (Ермаков, 1987). К 0.2 мл супернатанта последовательно добавляли 0.2 мл 0.5%-ного о-фенантролина в 96%-ном этаноле и 0.2 мл 0.2%-ного FeCl3 в 96%-ном этаноле. Затем обьем доводили до 3 мл 96%-ным этанолом и выдерживали 10 мин в темноте. Расчет антиоксидантов проводили по калибровочному графику, построенному для кверцетина. Количество антиоксидантов, содержащихся в проростках, рассчитывали в мкг/г сухой массы.

Активность пероксидазы определяли при 220С по начальной скорости окисления одианизидина или аскорбиновой кислоты перекисью водорода. К 2.0 мл 0.1 М натрийфосфатного буфера (рН 7.0), добавляли 0.2 мл раствора супернатанта и 0.1 мл 0.43 мМ раствора о-дианизидина в 96%-ном этаноле или 0.1 мл 5.5 мМ раствора аскорбиновой кислоты. Реакцию инициировали введением 0.1 мл 16 мМ перекиси водорода. Окисление одианизидина регистировали по увеличению поглощения при 460 нм, = 30 мМ-1см-Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 610 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2001/054.pdf (Лебедева и др., 1977), а аскорбиновой кислоты по уменьшению поглощения при нм, = 7000 М-1см-1 (Досон и др., 1991). За единицу активности фермента принимали количество о-дианизидина или аскорбиновой кислоты (мкмоль), окисленных за 1 мин 1 г сухой массы. Активность алкогольдегидрогеназы определяли, как описано в работе (Кершенгольц, Рогожин, 1979). Активность глюкозо-6-фосфатдегирогеназы определяли по методике (Рогожин, 1996). Содержание эндогенной аскорбиновой кислоты в семенах определяли по методике (Полевой, Максимов, 1978).

Спектрофотометрические исследования проводили на двухлучевом спектрофотометре DMS 100 S фирмы “Varian” (США).

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»