WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

РТГА + РТГА – Плацебо 2,CD4+CD45RO+ 2,1,1,0, 0,3,CD8+CD45RO+ 3,2,2,1,1,0,0,Рисунок 2. Индивидуальные показатели кратности изменения уровней (%) CD45RО+-лимфоцитов в периферической крови вакцинированных ЖГВ людей 18 – 20 лет. Столбик – величина кратности изменения у конкретного волонтёра. Кратность изменения – частное от деления поствакцинального уровня (%) на предвакцинальный. Значения: >1,0 – кратность прироста, <1,0 – кратность снижения, 1,0 –без изменения. РТГА(+) – лица с конверсиями сывороточных антител после вакцинации; РТГА(–) – лица с отсутствием конверсий этих антител после вакцинации. Пунктирной линией обозначены границы достоверности кратности изменения уровней клеток.

Средняя кратность увеличения уровня CD4+CD45RO+- и CD8+CD45RO+лимфоцитов оказалась самой высокой у волонтеров с поствакцинальной конверсией сывороточных антител в РТГА (в 1,6 и 1,9 раза соотвественно, p<0,01). У добровольцев, не давших прирост этих антител на прививку, этот показатель был меньше (в 1,2 и 1,5 раза соотвественно, p>0,05 и р<0,05 соотвественно). Самые низкие значения отмечены у лиц из контрольной группы (в 1,1 и 1,2 раза соотвественно, p>0,05).

У части людей наблюдалось снижение уровня изученных субпопуляций лимфоцитов в период между отборами образцов крови. Доля таких волонтеров среди РТГА-положительных составила 28 – 29%, среди РТГА-отрицательных – от 33 до 39%, а у людей из контрольной группы – от 64 до 72%.

Таким образом, приведенные на рисунке 2 результаты свидетельствуют о поствакцинальном повышении уровня изученных субпопуляций лимфоцитов не только у добровольцев с зафиксированным системным гуморальным иммунным ответом на прививку, но и у лиц с отсутствием такового. При этом иммунизация, как и в случае с авидитетом секреторных IgA-антител, изменяла интенсивность снижения уровня иммунологической памяти, опосредованной CD4+CD45RO+- и CD8+CD45RO+-лимфоцитами.

Рассмотрение индивидуальных показателей кратности поствакцинального прироста уровней клеток памяти у каждого отдельного добровольца, в сравнении с аналогичными показателями у лиц контрольной группы, позволило установить границы достоверности получаемых результатов – увеличение уровня клеток в 1,5 и более раз (рис. 2). Доля этих лиц среди привитых РТГА-положительных волонтеров составила 36 и 57%, среди привитых РТГА-отрицательных 11 и 22%, тогда как у людей из контрольной группы не наблюдалось ни одного такого случая (рис. 3).

60 57,% 35,22,11,CD4+CD45RO+ CD8+CD45RO+ Рисунок 3. Показатели достоверного увеличения уровня общих Т-лимфоцитов памяти в периферической крови людей 18 – 20 лет после вацинации ЖГВ. По оси абсцисс – фенотипы клеток. По оси ординат – процент лиц с достоверным (в 1,5 раза) увеличением уровней данных клеток. – лица с достоверными приростами титров сывороточных антител в РТГА (n=14); – лица, не давшие такого прироста(n=18); – лица, получившие препарат плацебо(n=25).

Проведенный корреляционный анализ совпадения случаев достоверного увеличения у вакцинированных добровольцев уровней CD4+CD45RO+- и CD8+CD45RO+-лимфоцитов показал очень высокую степень зависимости между данными показателями: коэффициенты корреляции колебались от 0,84 до 0,90 при p<0,01. Это свидетельствует, что, в принципе, факт поствакцинальной активации Тклеточной памяти можно фиксировать даже при определении только одной из двух субпопуляций Т-лимфоцитов памяти.

Установлено, что между исходными (перед введением ЖГВ) уровнями изученных субпопуляций клеток памяти и кратностью их поствакцинального увеличения существует обратная зависимость, то есть, чем ниже был исходный уровень, тем выше кратность его увеличения и наоборот (коэффициенты корреляции от –0,36 до –0,52 при p<0,05).

В итоге можно отметить, что проведенные исследования свидетельствовали о способности ЖГВ индуцировать Т-клеточную иммунологическую память в виде увеличения в периферической крови молодых людей уровней (%) общих CD4+CD45RO+- и CD8+CD45RO+-лимфоцитов.

Оценка у людей и животных иммунологической памяти по тестированию вирусспецифических Т- и В-лимфоцитов Важным фактором постинфекционного и поствакцинального иммунитета к острым инфекциям является формирование иммунологической памяти в виде специфических к возбудителю Т-клеток [Нalwani R. et al, 2006; Takahashi Y., 2007;

Sanz I. et al, 2008]. Только в последние годы вопрос об индукции Т-клеток памяти перешел в плоскость практического изучения в связи с разработкой методик их тестирования.

До недавнего времени в мировой практике для количественного измерения ex vivo антигенспецифических Т-клеток использовались два метода: тетрамерный и цитокиновый.

Тетрамерный метод [Gilanders W.E. et al, 1997; Novak E.J. et al, 1999] основан на специфическом взаимодействии TCR Т-лимфоцита с мультимерным (чаще всего тетрамерным) комплексом, представляющим собой молекулу МНС, связанную с пептидом вирусного антигена. Несмотря на высокую специфичность метод имеет ряд недостатков, прежде всего – сложность рекомбинантной технологии получения комплекса МНС-пептид. Кроме того, метод выявляет популяцию Т-клеток, специфичных только к данному комплексу МНС-пептид, и не дает полного представления о суммарном Т-клеточном ответе на все антигенные эпитопы.

Второй метод основан на выявлении антиген-активированных Т-лимфоцитов по внутриклеточному выявлению продукции Th-1 и Th-2 цитокинов [Prussin C., Metcalfe D.D., 1995]. По сравнению с тетрамерной технологией он более прост и дешев и используется гораздо шире. Однако цитокиновый метод не является витальным тестом (см. ниже) и требует достаточно длительной стимуляции in vitro клеток антигеном для формирования полноценного цитокинового ответа.

На сегодняшний день альтернативой перечисленным двум тестам является метод TRAP [Daubeuf S. et al, 2006], базирующийся на открытом феномене трогоцитоза [Joly E., Hudrisier D., 2003] – обмена участками клеточных мембран между АПК и Т-лимфоцитом в процессе презентации антигена. Выбор нами этого метода связан с тем, что он имеет ряд существенных преимуществ по сравнению с двумя первыми тестами:

- TRAP более прост, менее дорогостоящ, результаты можно получить в течение 24 часов [Daubeuf S. et al, 2006];

- в отличие от тетрамерной технологии он не требует МНС-типирования и знаний об особенностях презентации отдельного антигена [Puaux A.L. et al, 2006];

- позволяет осуществлять определение активированных Т- и В-клеток в одной пробе [Puaux A.L. et al, 2006];

- в отличие от метода определения внутриклеточных цитокинов TRAP является витальным тестом, то есть исследуемые клетки можно не подвергая фиксации использовать для дальнейших прижизненных исследований [Daubeuf S. et al, 2006];

- выявляет межклеточные реакции уже на этапе взаимодействия АПК с лимфоцитом, поскольку трогоцитоз начинается через несколько минут после контакта этих клеток [Joly E., Hudrisier D., 2003; Rechavi O. et al, 2007].

По данным литературы информация, полученная в TRAP, хорошо коррелирует с результатами тетрамерного и цитокинового методов [Puaux A.L. et al, 2006; Beadling C., Slifka M.K., 2006].

Ранее TRAP использовался в условиях in vitro на клеточных линиях [Puaux A.L. et al, 2006; Machlenkin A. et al, 2008]. Проведено только одно исследование in vivo в эксперименте на мышах [Beadling C., Slifka M.K., 2006]. Поэтому первой задачей настоящего раздела работы являлась адаптация данной методики для тестирования специфических к вирусу гриппа клеток памяти у людей.

Разработанная нами модификация TRAP в значительной мере отличалась от модификации, использовавшейся авторами [Beadling C., Slifka M.K., 2006] – рис. 4.

Активность трогоцитоза определяли в общем пуле вирусспецифических В- и Т-лимфоцитов памяти и в субпопуляции CD4+-лимфоцитов.

Испытания модификации TRAP при исследовании образцов периферической крови 25 условно здоровых невакцинированных ЖГВ добровольцев 18 – 20 лет показало, во-первых, наличие значительных колебаний индивидуальных показателей содержания клеток памяти, специфических к вакцинному штамму вируса гриппа А (H1N1), во-вторых, довольно низкие значения их уровней. Так, показатели концентрации изученных клеток варьировали от 0,01 до 1,15%, то есть могли отличаться в 100 и более раз.

На следующем этапе работы была проведена апробация разработанной модификации TRAP при исследовании образцов периферической крови людей 18 – 20 лет, отобранных до и спустя 1 месяц после прививки вакцинным штаммом для ЖГВ (рис. 5). Контрольной группой служили лица, получившие препарат плацебо.

Выбор интервала между двумя отборами проб крови (1 месяц) был сделан по следующим причинам:

- во-первых, он гарантировал тестирование во второй пробе именно клеток памяти, поскольку у людей элиминация вакцинного вируса после прививки отечественной ЖГВ происходит не позднее 7 дня с момента введения препарата [Александрова Г.И., Климов А.И., 1994], что Периферическая кровь человека Выделение МПК АПК Эф Эффекторы Мишени (АПК) Эффекторы Мишени (АПК) Этап I – выделение и Нагрузка АПК АПК Контроль стимуляция клеток вирусом + – Окраска CFSE Биотинилирование АПК CFSE Этап II – метка клеток Эф АПК АПК Эф + – Инкубация 1 час Эф АПК Смешивание 1:Этап III – индукция АПК Эф – Трогоцитоз трогоцитоза + Трогоцитоз спонтанный (фон) стимуляционный Этап IV – проведение Эф Эф ПЦФ Окраска стрептавидином Свечение вступивших (реакция биотин- в трогоцитоз клеток ПЦФ ПЦФ стрептавидин) (Т-, В-лимфоцитов – + любые анти-CD в зависимости от СD-маркеров) Рисунок 4. Схематическое отображение этапов постановки TRAP. МПК – мононуклеары периферической крови; Эф – клетки-эффекторы;

АПК – клетки-мишени – антиген-презентирующие клетки; CFSE – внутриклеточный флюорохром; ПЦФ – проточная цитофлюориметрия.

Знаками (+) и (–) обозначены соответственно мишени, стимулированные или нестимулированные вирусом.

сопровождается быстрой апоптотической выбраковкой эффекторных клеток [Lenardo M.J., 1997];

- во-вторых, отбор второй пробы крови в более отдаленные сроки мог привести к тому, что он совпал бы с эпидемией, когда трудно отдифференцировать причину индукции клеток памяти – собственно вакцинация или гриппозная инфекция. В нашем случае вторая проба отбиралась в предэпидемический сезон.

До- и поствакцинальные средние уровни специфических к вакцинному вирусу гриппа А(H1N1) клеток памяти (общий пул В- и Т-лимфоцитов и CD4+ Тлимфоцитов) определяли у добровольцев, давших (РТГА+) и не давших (РТГА-) достоверный прирост титров сывороточных антител в РТГА. Предвакцинальные уровни изученных субпопуляций лимфоцитов в группе РТГА-положительных людей оказались в 7,0 и 12,1 раза ниже по сравнению с РТГА-отрицательными (p<0,001). После введения ЖГВ средние уровни пула Т- и В-клеток и CD4+лимфоцитов увеличились у первых в 19,2 и 25,6 раза соответственно (p<0,001), а у вторых, только в 2,2 и 1,4 раза (p<0,01 и р<0,05). В контрольной группе наблюдалось снижение показателей.

0,Пул Т-, В- лимфоцитов памяти % 0,0,0,0, 0,0,0,0,0,0,0,РТГА (–) РТГА (+) Плацебо СD4+ Т-лимфоциты памяти % 0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,РТГА (+) РТГА (–) Плацебо Рисунок 5. Средний арифметический показатель доли (%) специфических к вирусу гриппа A(H1N1) лимфоцитов памяти в периферической крови вакцинированных ЖГВ людей 18 – 20 лет (по данным TRAP). По оси абсцисс: РТГА(+) и РТГА(-) – лица соответственно давшие (n=10) и не давшие (n=10) достоверный прирост титров сывороточных антител в РТГА после прививки. Контрольная группа - лпацебо (n=10). По оси ординат – % определяемых клеток от числа соответственно всех лимфоцитов или СD4+ лимфоцитов. – средние уровни клеток до вакцинации; – средние уровни клеток через месяц после вакцинации.

Эти данные свидетельствуют о влиянии исходных фоновых уровней вирусоспецифических клеток памяти как на кратноность их возрастания, так и на гуморальный иммунный ответ в РТГА после прививки. Кроме того, у привитых добровольцев была обнаружена обратная зависимость между исходными уровнями перед вакцинацией пула Т- и В-лимфоцитов памяти и CD4+-лимфоцитов памяти, с одной стороны, и накоплением этих клеток, с другой. Коэффициенты корреляции между данными признаками колебались от –0,54 до –0,84 при p<0,05 и <0,01.

У сравнительно небольшой части волонтеров (20 и 30%) было отмечено увеличение уровня клеток памяти после введения препарата плацебо. Как и в случае с общими CD45RO+-лимфоцитами памяти, возник вопрос о критерии достоверности полученных результатов. Рисунок 6 содержит сведения по этому вопросу.

Пул Т-, В- лимфоцитов памяти РТГА (+) РТГА (–) Плацебо 0,0,СD4+ Т-лимфоциты памяти РТГА (+) РТГА (–) Плацебо 0,0,Рисунок 6. Индивидуальные показатели кратности изменения уровней специфических к вирусу гриппа A(H1N1) лимфоцитов памяти у людей 18 – 20 лет после иммунизации ЖГВ (по данным TRAP). РТГА(+) и РТГА(–) – лица соответственно давшие и не давшие достоверный прирост титров циркулирующих антител в РТГА после прививки. По оси ординат – кратность изменения уровней клеток. Кратность изменения – частное от деления поствакцинального уровня (%) на предвакцинальный. По оси абсцисс – столбики, отражающие индивидуальные данные по каждому волонтеру. Пунктирной линией обозначены границы достоверности кратности изменения уровней клеток.

В группе людей, получивших препарат плацебо, не было зафиксировано ни одного случая с десятикратным и более возрастанием уровня вирусспецифических CD4+-лимфоцитов. В той же контрольной группе в отношении пула вирусспецифических Т- и В-лимфоцитов данный показатель не превышал пятикратное увеличение. Эти результаты позволили определить границу достоверности в отношении кратности поствакцинального увеличения клеток памяти в периферической крови людей: для пула Т- и В-лимфоцитов – в 5 и более раз, для CD4+-лимфоцитов памяти – в 10 и более раз.

По этим критериям среди РТГА-положительных людей доля лиц, давших достоверные увеличения пула Т- и В-лимфоцитов памяти и CD4+-лимфоцитов памяти, составила соответственно 80 и 70%, среди РТГА-отрицательных – соответственно 60 и 40% (рис. 7).

% пул Т-, В- лимфоцитов памяти CD4+ Т-лимфоциты памяти Рисунок 7. Показатели достоверного увеличения уровней специфических к вирусу гриппа А (H1N1) лимфоцитов памяти в периферической крови людей 18 – 20 лет после вакцинации ЖГВ. По оси абсцисс:

фенотипы лимфоцитов. По оси ординат – процент лиц с достоверным увеличением уровней клеток памяти после вакцинации. – лица, с достоверными приростами титров сывороточных антител в РТГА после вакцинации (n = 10); -- лица, не давшие такого прироста (n = 10); – лица, получившие препарат плацебо (n = 10).

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»