WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

(Т1:Т0,25)+( Т1:Т0,5)+(T1:T1) ИА = ---------------------------------, где tmax Т1, Т0,5, Т0,25 – обратные величины титров антител соответственно после инкубации СВДП в течение 1 часа, 0,5 часа и 0,25 часа. tmax – время достижения максимального титра, то есть через 1 час или 0,5 часа или 0,25 часа. В случае, когда титры секреторных IgA были меньше 1:8, индексы авидности считали равными 1,0; при титрах от 1:8 до 1:16 – равными 2,0; для тиров свыше 1:16, индексы авидности всегда были выше 2,0.

Распределение лимфоцитов по мембранным маркерам. Для определения количества (%) Т-клеток фенотипов CD4+СD45R0+, CD8+СD45R0+ и CD4+СD45RA+, CD8+СD45RA+ использовали моноклональные антитела к этим молекулам («BD Biosciences Pharmigen», CША). Клетки окрашивали по стандартному протоколу, предоставленному производителем в инструкции к антителам. Учёт результатов проводили по данным проточной цитометрии на приборе «COULTER EPICS XL», США.

Вирусспецифические T-клетки в периферической крови людей и мышей определяли с использованием модифицированного метода TRAP (T-cell recognition of antigen presenting cells by protein capture), основанного на опубликованных методиках [Beadling, Slifka, 2006; Daubeuf et al., 2006]. Схема метода представлена на рис. 4. Для фенотипирования клеток применяли антитела к СD4 человека или к CD8 и CD44 мыши (BD Biosciences Pharmigen, USA). Результаты учитывали по данным проточной цитометрии на приборе «COULTER EPICS ALTRA», США.

Статистические методы. Статистический анализ проводился в программе «МS Excel» c применением непарамертических методов (U-критерий Манна-Уитни, тест Вилкоксона для парных сравнений и коэффициент корреляции по Спирмену).

За уровень статистической значимости была принята p<0,05. Средние величины уровней локальных IgA и антигемагглютинирующих антител представлены в виде средних геометрических обратных значений титров (СГТ).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Оценка у людей локальной В-клеточной иммунологической памяти по критерию авидитета секреторных IgA-антител В целом вопрос о формировании иммунологической памяти во входных воротах инфекции носит дискуссионный характер [Ярилин А.А., 1999; Takahashi Y., 2007; Sanz I. et al, 2008]. Это относится и к локальным В-клеткам памяти.

Существует несколько методов оценки В-клеточной памяти: (i) по количественному определению в ELISPOT плазматических клеток, секретирующих антитела различных изотипов; (ii) по тестированию в проточной цитометрии уровней Вклеток, несущих мембранные маркеры памяти CD27, CD38, IgD–, Bcl-2; (iii) по повышению авидности продуцируемых антител при повторных контактах организма с возбудителем. Нами был выбран последний метод, поскольку, вопервых, он более прост, во-вторых, отражает функциональное состояние Вклеточной памяти, в-третьих, не требует выделения клеток. Кроме того, сведения об авидитете локальных антител в литературе отсутствовали.

Адаптированы два метода количественной оценки в ИФА авидности локальных антител к вирусам гриппа А и В, ранее применявшиеся только для изучения авидитета сывороточных иммуноглобулинов [Найхин A.H. и др, 1995;

Souza V. et al, 1997; Paunio M. et al, 2003] – динамический тест и тест с мочевиной.

Эти тесты неравнозначны по своей сути, поскольку первый измеряет авидитет с позиции скорости реагирования антитела с антигеном (время достижения максимального титра) и интенсивности иммунной реакции (частное от деления максимального титра на минимальный), тогда как второй в большей мере оценивает авидитет с точки зрения прочности соединения антигена с антителом на основании количественных данных о разрыве слабоавидных связей под действием мочевины.

Обследование 109 условно здоровых лиц 18 – 20 лет, ранее не прививавшихся ЖГВ, показало наличие широкого диапазона индивидуальных показателей авидности локальных IgA-антител. Так, по данным теста с мочевиной и динамического теста, значения индексов авидности этих антител колебались соответственно от 33 до 96% и от 1 до 23. Полученные результаты позволили произвести разделение добровольцев на три группы: с низким авидитетом антител (индексы авидности в тесте с мочевиной от 33 до 60% и в динамическом тест от 1 до 3), средним (индексы авидности соответственно от 61 до 80% и от 4 до 7) и высоким (индексы авидности соответственно от 81 до 96 % и от 8 до 23).

Далее на материале обследования тех же лиц был проанализирован вопрос о связи между титрами и индексами авидности секреторных IgA-антител.

Актуальность такого анализа заключалась в том, что в случае наличия полного совпадения этих показателей, необходимость оценки антител по ИА отпадает, поскольку о нем можно будет судить по величине титров.

Оказалось, что у части людей (до 50%) наблюдались расхождения в этих данных, то есть наличие у волонтеров локальных IgA-антител с высокими индексами авидности при низких титрах и, наоборот, c низкими индексами при высоких титрах. Кроме того, коэффициент корреляции между показателями теста с мочевиной и динамического теста, с одной стороны, и титрами антител, с другой, не был статистически значимым (0,22 и 0,47 соотвественно, p>0,05).

Обобщая результаты этой части работы, можно отметить, что проведенное обследование непрививавшихся ЖГВ людей позволило, во-первых, убедиться в хорошей воспроизводимости двух использованных методов оценки авидности IgA в СВДП, во-вторых, выбрать конкретные параметры такой оценки.

На следующем этапе методы были апробированы на материале обследования добровольцев, иммунизированных вакцинными штаммами вирусов гриппа А (H1N1) и В.

При разработке любого иммунологического метода важно установить, происходит ли изменение его показателей под влиянием антигенного стимула. Это, с одной стороны, является проверкой специфичности теста, а с другой – дает представление о действии препарата с точки зрения его способности индуцировать изучаемые факторы иммунитета. Сказанное в полной мере относится и к авидности антител.

После прививки волонтеров вакцинными штаммами для ЖГВ средние геометрические титры локальных IgA к вирусам гриппа А (H1N1) и В увеличились соответственно в 2,3 (p<0,001) и 2,1 (p<0,01) раза, а доля лиц, давших достоверный прирост этих антител, составила соответственно 50 и 39%. В группе лиц, получивших препарат плацебо, эти показатели не превышали 3,7% (1 человек).

Таким образом, штаммы обладали достаточной иммуногенностью в отношении индукции локального гуморального иммунного ответа.

Далее мы проследили характер изменений индексов авидности секреторных IgA в до- и поствакцинационный периоды у трех групп волонтеров: (i) у привитых с наличием достоверного прироста в ИФА локальных антител; (ii) у привитых с отсутствием такого прироста и (iii) у получивших препарат плацебо (рис. 1).

Тест с мочевиной Динамический тест 40 % % 64,3 64,3 64,35, 32,52,30 28,42,9 42,19,9, 5 3,ИФА(+) ИФА(–) Плацебо Плацебо ИФА(+) ИФА(–) Рисунок 1. Авидность локальных IgA-антител к вирусу гриппа А (H1N1) у привитых ЖГВ добровольцев в зависимости от наличия или отсутствия локального иммунного ответа на вакцинацию. По оси абсцисс: ИФА(+) – лица, давшие после вакцинации достоверный прирост титров IgA-антител в секретах верхних дыхательных путей (n=28); ИФА(–) – лица, не давшие такого прироста(n=28); плацебо – лица, получившие препарат плацебо(n=21). По оси ординат: процент лиц, с высокими показателями авидности антител (для теста с мочевиной – индексы авидности 81 – 96%, для динамического теста – индексы авидности 8 – 23). – до вакцинации; – после вакцинации.

После иммунизации среди вакцинированных волонтеров с наличием достоверной конверсии секреторных IgA-антител, доля лиц с высокими показателями индексов авидности к вирусу гриппа А (H1N1), по данным теста с мочевиной и динамического теста, увеличилась соответственно в 8,9 (р<0,001) и в 1,5 раза (р<0,05). У привитых людей без достоверного накопления IgA-антител эти показатели либо изменились очень незначительно (p>0,05), либо не изменились вообще, а у добровольцев, получивших препарат плацебо они даже снизились.

Результаты, полученные при изучении авидности секреторных IgA-антител к вирусу гриппа В, значительно не отличались.

Таким образом, после прививки ЖГВ количественное накопление антител в секретах верхних дыхательных путей сопровождалось увеличением их авидности.

Выраженность этого увеличения зависила от количественных характеристик авидитета, на фоне которых осуществлялась прививка.

При измерении индивидуальной авидности антител у конкретного вакцинируемого человека важно зафиксировать не только изменения данного показателя после вакцинации, но и установить величины достоверности такого изменения, так как нельзя исключить, что в каких-то пределах значения индексов авидности антител могут быть подвержены не связанным с вакцинацией неспецифическим колебаниям в промежуток между отбором проб. Результаты такого анализа для обоих тестов представлены в таблице 1. При выработке этих критериев опирались на наиболее надежный биологический принцип достоверности – отсутствие увеличения измеряемого признака в контрольной группе, то есть группе, получавшей препарат плацебо.

Таблица Диапазон изменения авидности локальных IgA-антител к вирусам гриппа А (H1N1) и В у привитых людей Число и доля (%) лиц с измененными индексами авидности антител Вирус Число Тест с мочевиной Динамический тест Группа гриппа лиц Сниже Увеличение на Сниже- Увеличение в -ние ние 1 – 15% 16 – 24% 25% 1,0 – 1,4 1,5 – 4,2 2,4 16 7 1 4 9 5 А ИФА(+)* 14,3% 57,1% 25,0% 3,5% 14,3% 32,1% 17,9% 35,7% (H1N1) 12 9 6 11 Плацебо* 21 0 0 57,1% 42,9% 28,6% 52,4% 19,0% 5 6 2 9 4 10 7 ИФА(+) 22,7% 27,3% 9,1% 40,9% 18,2% 45,4% 31,8% 4,5% B 14 13 9 12 Плацебо 27 0 0 51,9% 48,1% 33,3% 44,4% 22,2% ИФА(+) – лица, давшие достоверный прирост титров IgA-антител в СВДП после вакцинации;

Плацебо – лица, получившие препарат плацебо.

По данным теста с мочевиной, достоверный показатель находился в пределах поствакцинального увеличения индексов авидности антител к вирусам гриппа А и В на более чем 15%, а по данным динамического теста – в 2,5 и более раза.

Обращает на себя внимание тот факт, что доля лиц в контрольных группах со снижением показателей авидности антител в период между отборами секретов оказалась в 4,1 (вирус гриппа А, р<0,001) и в 2,7 (вирус гриппа В, р<0,01) раза выше, по сравнению с аналогичными показателями в группе привитых по данным теста с мочевиной. Это косвенно свидетельствует, что вакцинация не только увеличивает авидитет секреторных IgA, но тормозит скорость снижения данного покзателя, то есть влияет на длительность сохранения высокоавидных иммуноглобулинов.

При анализе вопроса о широте информации, получаемой в обоих тестах измерения авидности локальных IgA-антител, оказалось, что из иммунизированных лиц, у 21 волонтера (38%) было зафиксировано достоверное возрастание индексов авидности антител в одном сравниваемом тесте без констатации такого возрастания в другом.

Таким образом, по уровню информации о поствакцинальных сдвигах в авидности антител тест с мочевиной и динамический тест полностью не «перекрывали» друг друга.

Ранее отмечено существование обратной зависимости между исходными показателями авидитета циркулирующих сывороточных антител перед противогриппозной вакцинацией и выраженностью последующих изменений этого показателя в поствакцинальный период [Найхин A.H. и др, 1995]. Точно такая же зависимость наблюдалась и в отношении авидности секреторных IgA-антител. Так, по данным динамического теста, у привитых добровольцев с зафиксированным достоверным приростом авидности этих антител на прививку, средние значения их индексов авидности перед введением вакцинных штаммов составили 1,8 (вирус гриппа А) и 2,0 (вирус гриппа В), тогда как у лиц, которые не ответили достоверным увеличением индексов авидности на иммунизацию, этот показатель был намного выше – соответственно 8,7 и 8,2 (p<0,01). Аналогичная, но менее выраженная зависимость отмечена и по результатам теста с мочевиной. Проведенный статистический анализ индивидуальных данных показал наличие обратной корреляционной зависимости поствакцинальных уровней авидности этих антител от их исходных значений (коэфициенты корреляции между исходными значениями и кратностями их изменения для динамического теста и теста с мочевиной составили соотвественно -0,63 и -0,48 при р<0,05).

Таким образом, успешность постакцинального повышения авидитета секреторных IgA-антител зависела от фоновых предвакцинальных уровней авидности этих иммуноглобулинов.

В целом проведенные исследования с теоретических позиций показали способность живых реассортантных штаммов вируса гриппа А и В увеличивать у взрослых праймированных людей авидитет IgA-антител в верхнем отделе дыхательного тракта (входные ворота инфекции), а с точки зрения практики – разработать простые и доступные методы измерения авидности этих антител.

Оценка у людей Т-клеточной иммунологической памяти по выявлению в крови общих Т-лимфоцитов с мембранным фенотипом CD45RO+ Полноценность развития у людей поствакцинального иммунного ответа к возбудителям инфекций зависит от способности вакцинных штаммов индуцировать не только В-клеточную, но и Т-клеточную иммунологическую память.

Американскими авторами оценена иммуногенная активность инактивированной гриппозной вакцины (ИГВ) по индукции у людей циркулирующих общих CD4+CD45RO+ и CD8+CD45RO+ Т-клеток памяти [McElhaney J.E. et al, 1995]. Цель настоящего раздела работы заключалась в анализе данного вопроса в отношении ЖГВ. Ранее подобные исследования не проводились.

На примере вакцинации ЖГВ была предпринята попытка получить ответ на главный вопрос: происходит ли при интраназальном введении взрослым людям аттенуированного реассортантного вируса гриппа изменение уровня этих клеток памяти в периферической крови, и, если да, то какова количественная характеристика такого изменения.

На сегодняшний день отсутствуют общепринятые нормы содержания CD4+CD45RO+, CD8+CD45RO+ Т-клеток в периферической крови. Поэтому были изучены их количественные показатели у условно здоровых людей 18 – 20 лет, ранее не прививавшихся ЖГВ.

При подсчете от общего числа подвергшихся цитометрическому анализу лимфоцитов доля CD4+CD45RO+- и CD8+CD45RO+-лимфоцитов колебалась соответственно от 7 до 17% и от 2 до 11%. При этом наибольшие значения превышали наименьшие в 2,3 – 5,5 раза (p<0,01 и <0,001).

Таким образом, отмечено наличие значительных колебаний индивидуальных уровней изученных субпопуляций лимфоцитов в периферической крови молодых людей.

Далее были прослежены изменения уровня этих же клеток памяти у лиц того же возраста после вакцинации ЖГВ (рис. 2).

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»