WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

На правах рукописи

КОРЕНЬКОВ Даниил Анатольевич ОЦЕНКА ЖИВОЙ РЕАССОРТАНТНОЙ ГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНЫ ПО ИНДУКЦИИ В- И Т-КЛЕТОЧНОЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ ПАМЯТИ 14.00.36 – Аллергология и иммунология 03.00.06 – Вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2009 2

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии медицинских наук научноисследовательском институте экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН

Научный консультант: доктор медицинских наук Найхин Анатолий Нойевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Назаров Петр Григорьевич доктор медицинских наук Зазимко Любовь Александровна

Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение науки «НИИ эпидемиологии и микробиологии им.

Пастера Роспотребнадзора»

Защита диссертации состоится « » _ 2009 года в часов на заседании Диссертационного Совета ДМ 001.022.01 при НИИЭМ СЗО РАМН (197376, СанктПетербург, ул. Акад. Павлова, 12)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИЭМ СЗО РАМН.

Автореферат разослан «» 2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета Бурова Л.А.

доктор медицинских наук 3 Актуальность проблемы. Грипп, наряду с вирусными гепатитами и ВИЧинфекцией, является одной из главных вирусологических проблем. Мировой научной общественностью уделяется огромное внимание разработке методов предотвращения именно этих заболеваний. В настоящее время к самым эффективным способам борьбы с гриппом относят вакцинопрофилактику [Global pandemic influenza action plan to increase vaccine supply, WHO Document Production Services, 2006].

Качество противогриппозных вакцин, как и других вакцинных препаратов, оценивают по трем главным критериям: эпидемиологическая эффективность, безвредность и иммуногенность. До сих пор об иммуногенности гриппозных вакцин судят только по их способности стимулировать продукцию сывороточных антигемагглютинирующих антител. В последнее время развернута дискуссия о достаточности такой оценки [Meeting report: FDA/NIH/WHO public workshop on immune correlates of protection against influenza A viruses in support of pandemic vaccine development, Vaccine 26 (2008) 4299–4303].

Принцип вакцинации основан на создании у людей иммунологической памяти к возбудителю инфекции. За счет вакцинации организм при последующей встрече с патогеном отвечает ускоренной и усиленной мобилизацией факторов иммунной защиты. Поэтому совершенно логично, что главная задача вакцинальной иммунологии должна быть связана именно с оценкой препаратов по индукции иммунологической памяти [Медуницин Н.В., 2004; Welsh R.M. et al, 2004; Halwani R. et al, 2006]. В последние годы это направление активно развивается за рубежом [Lanzavecchia A., Sallusto F., 2005; Halwani R. et al, 2006; Takahashi Y., 2007; Sanz I.

et al, 2008; Galli G. et al, 2009]. В России подобные исследования не проводились.

Настоящая работа является первой попыткой комплексной оценки эффективности вакцинации людей по стимуляции В- и Т-клеточной памяти живыми реассортантными вакцинными штаммами, входящими в состав отечественной живой гриппозной вакцины (ЖГВ).

Цель исследования: изучить способность ЖГВ стимулировать В- и Тклеточную иммунологическую память.

Задачи исследования:

1. Разработать методические приемы оценки иммунологической памяти у людей.

2. На материале обследования добровольцев 18 – 20 лет, привитых ЖГВ и не прививавшихся этой вакциной, а также в экспериментальном исследовании in vivo изучить:

- локальную В-клеточную память по критерию авидитета секреторных IgAантител к вирусам гриппа;

- Т-клеточную память по выявлению общих циркулирующих лимфоцитов с мембранными маркерами CD45RO+;

- Т-клеточную иммунологическую память по определению уровней вирусспецифических циркулирующих лимфоцитов.

Научная новизна работы.

1. Впервые осуществлено исследование у людей В-клеточной иммунологической памяти к вирусам гриппа А и В по критерию авидитета локальных IgA-антител, включающее оценку количественных характеристик скорости, интенсивности и прочности образования иммунных комплексов. Показано, что иммунизация ЖГВ повышает эти показатели, т.е. увеличивает продукцию высокоавидных антител в верхнем отделе респираторного тракта.

2. Впервые проведена оценка ЖГВ по индукции у людей общих циркулирующих Тлимфоцитов иммунологической памяти фенотипов CD4+CD45RO+ и CD8+CD45RO+. Установлено, что введение ЖГВ вызывает увеличение уровня этих клеток в периферической крови.

3. Разработана модификация метода TRAP (T-cell recognition of antigen presenting cells by protein capture) для количественного определения у людей и животных специфических к вирусу гриппа А Т-клеток иммунологической памяти. С помощью данной методики показано, что вакцинация ЖГВ индуцирует продукцию этих клеток, отраженную в поствакцинальном увеличении их уровня в периферической крови.

4. Впервые осуществлено сравнение активности индукции на локальном уровне (назоассоциированная лимфоидная ткань мышей) вирусспецифических Т-клеток памяти при экспериментальной гриппозной инфекции и вакцинации животных живым реассортантным вирусом гриппа. Отмечено, что как при инфекции, так и при вакцинации происходит увеличение уровней вирусоспецифических CD8+CD44hi Т-лимфоцитов памяти в этой лимфоидной ткани.

Практическая значимость работы.

1. Разработан метод количественного измерения в иммуноферментном анализе авидности IgA-антител к вирусам гриппа А и В в секретах верхних дыхательных путей. Метод дает возможность характеризовать эти иммуноглобулины одновременно по трем параметрам: (i) титры антител; авидность антител с точки зрения (ii) скорости и интенсивности соединения с антигеном, (iii) прочности соединения с антигеном.

2. Разработана модификация TRAP для количественного выявления у людей циркулирующих в крови Т-клеток, специфических к вирусу гриппа А.

3. Эти методы могут быть использованы для оценки индукции В- и Т-клеточной иммунологической памяти у людей, привитых различными гриппозными вакцинами.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Однократная прививка ЖГВ взрослых лиц, уже контактировавших ранее с возбудителями гриппа, вызывает стимуляцию В- и Т-клеточной иммунологической памяти.

2. Даже люди практически одного возраста (18 – 20 лет) весьма гетерогенны по показателям предвакцинального состояния иммунологической памяти к вакцинному штамму вируса гриппа А, входящему в состав ЖГВ.

3. Обнаружена обратная зависимость между предвакцинальными значениями изученных параметров В- и Т-клеточной иммунологической памяти и их поствакцинальными изменениями.

4. Имеются значительные расхождения между данными оценки иммунологических свойств ЖГВ по конверсии титров сывороточных антител в РТГА, с одной стороны, и по тестированию поствакцинальных изменений уровней вирусспецифических Т-клеток памяти, с другой.

Личный вклад автора заключается в непосредственном участии в клинических испытаниях, самостоятельном проведении всех лабораторных исследований, анализе материалов, статистической обработке полученных результатов. Вклад соавторов состоит в помощи при отборе волонтеров, проведения вакцинации и сборе материалов в клинических испытаниях с участием добровольцев, а также в освоении и постановке новых методов исследования (Донина С.А., Григорьева Е.П., Петухова Г.Д., Чиркова Т.В.).

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на X Всероссийском Научном Форуме с международным участием им. акад. В.И. Йоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 29 мая – 1 июня 2006 г.);

Объединенном Иммунологическом Форуме (Санкт-Петербург, 30 июня – 5 июля 2008 г.); The Third European Influenza Conference (Vilamoura, Portugal, September 14 – 17, 2008); Школе-Конференции для молодых ученых «Методы культивирования клеток» (Санкт-Петербург, 6 – 10 октября 2008 г.).

Диссертационная работа апробирована на совместной научной конференции отделов иммунологии и вирусологи НИИЭМ СЗО РАМН «9» апреля 2009 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3 статьи и 6 тезисов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка цитируемых литературных источников. Работа изложена на 135 страницах текста, включающего 20 таблиц и 15 рисунков. Список цитируемой литературы содержит 175 источников, в том числе 20 отечественных и 155 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Животные. Для воспроизведения экспериментальной гриппозной инфекции и вакцинации использовали линейных мышей CBA/J (самок) в возрасте 8 – 10 недель, полученных из питомника «Рапполово» РАМН.

Модель экспериментальной гриппозной инфекции и вакцинации.

Уровни клеток иммунологической памяти в назоассоциированной лимфоидной ткани (НАЛТ) мышей изучали на экспериментальной модели, разработанной ранее в отделе вирусологии НИИЭМ СЗО РАМН. Животным вводили следующие вирусы гриппа: (i) патогенный для мышей A/PR/8/34 (H1N1) в дозе 4,0 lg ЭИД50 – моделирование естественной гриппозной инфекции; (ii) аттенуированный реассортантный вирус A/47/PR/8/34 (H1N1) в дозе 6,0 lg ЭИД50 – моделирование вакцинации ЖГВ; (iii) инактивированный формалином вирус A/47/PR/8/34 (H1N1) в дозе 10 мкг по гемагглютинину - моделирование вакцинации инактивированной гриппозной вакциной. Реассортант имел 2 гена наружных белков от вируса (i) и 6 генов внутренних белков от вируса гриппа А/Ленинград/134/47/(H2N2). Вирусы вводились под легким эфирным наркозом, живые – интраназально в объеме 50 мкл (по 25 мкл в каждый носовой ход), а инактивированный – парентерально (внутрибрюшинно) в объеме 200 мкл. В качестве контроля использовались интактные животные. Уровни клеток памяти в НАЛТ определяли на 7 и 60 сутки после введения вирусов.

Волонтеры и вакцинация. Во всех исследованиях участвовали условно здоровые молодые люди 18 – 20 лет, не имевшие противопоказаний к вакцинации ЖГВ. В исследованиях по формированию авидитета секреторных антител было обследовано 109 непривитых волонтеров, 112 лиц, вакцинированных рекомендованными ВОЗ аттенуированными реассортантными штаммами для ЖГВ:

A/17/Соломоновы Острова/06/9 (H1N1) или B/60/Флорида/04/181. 48 лиц получили препарат плацебо (стерильный физиологический раствор). В исследованиях уровней CD45RO+ и CD45RA+ Т-лимфоцитов участвовали 85 непривитых людей, человека, вакцинированных тривалентной коммерческой ЖГВ; 25 лиц составили контрольную группу - плацебо. В состав ЖГВ входили реассортантные штаммы, рекомендованные ВОЗ: А/17/Новая Каледония/99/145 (H1N1), А/17/Калифорния/04/6 (H3N2) и B/60/Джилин/01/1. Для изучения изменений в уровнях вирусспецифических Т-лимфоцитов памяти обследовано 25 непривитых добровольцев, 20 вакцинированных и 10 получивших препарат плацебо.

Вакцинация проводилась реассортантным штаммом для ЖГВ A/17/Соломоновы Острова/06/9 (H1N1), рекомендованным ВОЗ.

Все вирусы вводили однократно, интраназально, по 0,25 мл в каждый носовой ход. Лицам из группы плацебо таким же способом вводился стерильный физиологический раствор. Медицинский осмотр и забор венозной крови у добровольцев проводили до вакцинации и через 1 месяц после вакцинации. Отбор секретов верхних дыхательных путей осуществляли до и через 21 день после введения препаратов. От каждого волонтёра было получено письменное добровольное информированное согласие об участии в исследовании.

Выделение лимфоцитов НАЛТ. Сепарацию НАЛТ осуществляли по ранее разработанной методике[Asanuma H. et al., 1997]. После цервикальной дислокации у мышей отделяли верхнюю челюсть кзади от глазных яблок и удаляли кожу. Далее выделенную часть черепа освобождали от мозга, мышц и тканей наружного носа вместе с верхними резцами. После сепарации небной пластинки выделяли непосредственно НАЛТ – парные лимфоидные образования по бокам от носовой перегородки. НАЛТ осторожно гомогенизировали с помощью предметных стекол с матовым краем. Приготовление суспензии лимфоцитов осуществляли общепринятым методом [Current Protocols in Immunology, 2003].

Выделение и приготовление суспензии мононуклеаров периферической крови (МПК) людей осуществляли центрифугированием в градиенте плотности Histopaque-1077 традиционным способом [Current Protocols in Immunology, 2003].

Иммуногенность ЖГВ оценивали по уровню антигемагглютинирующих сывороточных антител в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). В качестве антигена использовали по 4 гемагглютинирующие единицы вирусов гриппа А или В, входящих в состав вакцины. Перед постановкой РТГА сыворотки инкубировали с RDE (II) (receptor destroying enzyme, “Seiken”, Япония) и прогревали в течении 0,часа при 56С.

IgA-анитела в секретах верхних дыхательных путей (СВДП) определяли в непрямом варианте иммуноферментного анализа (ИФА) по ранее разработанной методике [Донина С.А. и др., 1997]. За титр антител принимали последнее разведение образца, оптическая плотность (ОП) которого превышала в 2 и более раза среденее арифметическое значение ОП контрольных лунок (все компоненты кроме образцов СВДП).

Авидность локальных IgA-антител у людей в тесте с мочевиной определяли в ИФА по методике [de Souza V.A. et al., 2003], модифицированной в части, касающейся его адаптации для исследования СВДП. Расчёт индекса авидности (ИА) осуществляли по формуле:

среднее арифметическое ОП в лунках, обработанных мочевиной ИА = ------------------------------------------------------------------------------------ х100, (%) среднее арифметическое ОП в контрольных лунках Авидность локальных IgA-антител у людей в динамическом варианте ИФА проводили по ранее разработанной методике [Найхин А.Н. и др., 1993], основанной на определении скорости и интенсивности образования комплекса антиген-антитело. Индексы авидности (ИА) рассчитывали по формуле:

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»