WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 10 |

фермента избытком субстрата и вызвать ингибирование глюкозо-6- Поэтому в дегидрогеназных реакциях катализируемых АДГ может участвовать в фосфатдегидрогеназы большими концентрациями NADP. По-видимому, данный основном восстановленная форма кофермента. Использование ферментом регуляторный механизм способствует выполнению важной функциональной различных коферментов, позволяет предположить об огромных адаптационных роли фермента в обеспечении состояния гипобиоза семян пшеницы и при их возможностях, заложенных в механизме действия АДГ, прорастании. Выход семян из состояния покоя сопровождается активизацией процессов гидролиза крахмала, в результате чего образуется большое количество G6P, который Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 493 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2001/044.pdf -15- -16которые могут быть реализованы для поддержания высокой жизнеспособности семян с различными формами покоя. метаболические процессы, увеличивающие концентрацию АТФ в проростке, Используя ртутьсодержащие соединения (HMB и CMB) показано, что в в результате содержание нуклеозидфосфатов начинает накапливаться в системе.

активном центре АДГ семян пшеницы имеются функционально важные SH- Избыточное содержание АТФ в проростках приводит к ингибированию АДГ, что группы, химическая модификация которых полностью ингибирует фермент. и проявляется в виде понижения активности фермента при прорастании Установлено, что число SH-групп, принимающих участие в катализе равно проростков пшеницы. Следовательно, АТФ может выполнять роль регулятора двум. При этом SH-группы участвуют как в реакциях окисления этанола, алкогольдегидрогеназной активности, осуществляя направленное переключение так в реакциях восстановления ацетальдегида. Наличие неконкурентного типа процессов с анаэробных на аэробные, при повышении функциональной ингибирования свидетельствует о том, что связывание ингибитора не активности митохондрий.

происходит в месте связывания субстратов АДГ (этанола и ацетальдегида). Выявленные закономерности позволяют предположить, что в действии Однако связывание ингибиторов вызывает существенные изменения в основных ферментов гипобиоза заложены регуляторные механизмы, которые конформации фермента, в результате чего нарушается нормальное обеспечивают запрограммированное управление их функциональной взаимодействие субстрата с активным центром фермента. Поэтому местом деятельностью в нормальных условиях и эти же механизмы начинают локализации SH-групп, по-видимому, является кофермент связывающий проявляться при возникновении условий угрожающих жизнедеятельности участок, а их модификация HMB и CMB может оказывать влияние как на системы в экстремальных условиях. Причем регулирование деятельности связывание кофермента, так и на его превращение, проявляясь в смешанном ферментов, может осуществляться с помощью естественных субстратов типе ингибирования АДГ ртутьсодержащими соединениями. Использование метаболических процессов, которые помимо своей основной функции могут в ртутьсодержащих соединений позволило нам разработать селективный метод экстремальных ситуациях регулировать активность ферментов, осуществляя титрования активных центров АДГ, что может быть использовано при направленное протекание метаболических процессов, обеспечивающих определении содержания фермента в различных биогенных тканях. формирование гипобиотических состояний.

Известно, что АТФ и другие нуклеозидфосфаты способны регулировать Таким образом, основные молекулярные механизмы формирования активность ключевых метаболических ферментов. К таким ферментам относятся гипобиотических состояний заложены в особенностях структуры ферментов и гексокиназа, пируваткиназа, фосфофруктокиназа и др. Поэтому мы изучили в регулировании их каталитической активности с помощью субстратов и влияние АТФ, АДФ и АМФ на кинетику реакций окисления этанола и биологически активных веществ, обладающих полифункциональной восстановления ацетальдегида, катализируемых АДГ. Показано, что деятельностью в клетках живых организмов.

нуклеозидфосфаты способны конкурентно ингибировать АДГ. Причем АТФ и АДФ сильнее ингибируют фермент в реакции восстановления ацетальдегида чем 2. Роль ферментов, функционально активных веществ и условий АМФ. При этом АТФ и АДФ более избирательно действуют на АДГ в реакции среды в формировании гипобиотических состояний восстановления ацетальдегида, что, по-видимому, связано с преимущественным Сравнение каталитических свойств АДГ семян культурного растения использованием, образующегося ацетальдегида в анаболических реакциях для (пшеницы) и дикорастущего (пырея ползучего), позволяет оценить степень синтеза функционально активных соединений, активизации аутоиммунных участия фермента в формировании устойчивости семян к экстремальным реакций за счет модификации NH2 - и других групп белков и частично для факторам среды и их адаптационный потенциал.

синтеза АТФ. В случае накопления АТФ в чрезмерно высоких концентрациях, В таблице 1 представлены величины Кm алкогольдегидрогеназ нуклеотиды способны ингибировать и прямую реакцию, предотвращая пшеницы и пырея ползучего. Наибольшие различия в значениях констант использование ацетальдегида в синтетических процессах, в том числе и в связывания этанола и ацетальдегида наблюдаются в физиологической области реакциях синтеза АТФ. Следовательно, АДГ семян при физиологических рН рН 6,0-7,5. Показано, что алкогольдегидрогеназой пшеницы ацетальдегид преимущественно способна катализировать реакцию накопления этанола, связывается в 10 раз эффективнее этанола, тогда как величины констант который в покоящихся семенах может выполнять роль основного связывания кофакторов NAD и NADН различаются незначительно.

энергетического субстрата метаболических процессов. За счет генерации Алкогольдегидрогеназа пырея ползучего связывает ацетальдегид в 8-10 раз этанола в семенах поддерживается их высокая жизнеспособность и лучше этанола, а NADН в 5-8 раз эффективнее по сравнению с NAD.

длительная сохранность. При этом реакция восстановления ацетальдегида Такие различия в связывании субстратов этанола и ацетальдегида АДГ находится под контролем эндогенных нуклеозидфосфатов (АТФ и АДФ), пшеницы обеспечивает определенную направленность дегидрогеназной реакции, избыток которых, по-видимому, может ингибировать фермент, регулируя таким в которой при физиологических рН осуществляется преимущественное образом уровень эндогенных этанола и ацетальдегида в семенах, находящихся в превращение ацетальдегида в этанол и генерация последнего в покоящихся состоянии вынужденного покоя. Тогда как при прорастании семян семенах для обеспечения, по-видимому, их энергетических потребностей. В активизируются семенах пырея ползучего накопление этанола Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 494 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2001/044.pdf -17- -18Таблица 1. Величины Кm (мМ) реакций окисления этанола и восстановления ацетальдегида алкогольдегидрогеназами семян пшеницы и пырея ползучего при lgkcat различных рН.

рН АДГ пшеницы АДГ пырея ползучего Km NAD KmNADH Km альд Km NAD KmNADH Km альд Kmэтанол Kmэтанол 5,8 0,42 14,3 0,13 2,0 - - - 6,5 0,20 17,0 0,25 0,7 0,58 20,0 0,11 0,7,0 0,19 20,0 0,52 1,8 0,32 11,0 0,05 1,7,5 0,35 16,0 0,54 1,6 0,31 11,0 0,07 1,7,9 0,43 - 0,67 - 0,27 9,0 0,13 1,8,0 - 14,7 - - - - - 8,5 0,33 - - 1,56 0,29 14,0 0,10 8,9,0 0,18 15,0 20,0 40,0 0,27 16,0 0,21 6,10,0 0,19 12,0 - - 0,27 15,0 0,14 9,10,7 0,22 17,0 - - 0,86 13,5 0,12 11,0 0,34 20,0 - - - - - может происходить еще интенсивнее, поскольку АДГ способна в 8-10 раз лучше pH связывать как ацетальдегид, так и NADН. Причем связывание NADН алкогольдегидрогеназой пырея ползучего в физиологической области рН (6,0Рис. 1. рН - зависимость kcat восстановления ацетальдегида (1,4) и окисления 7,5) в 7-10 раз эффективнее, чем АДГ пшеницы. При этом особые различия этанола (2,3) алкогольдегидрогеназами семян пшеницы (3,4) и пырея ползучего между алкогольдегидрогеназами пшеницы и пырея ползучего наблюдаются в (1,2). Условия: 23оС, буферные растворы 0,1 М: Na-фосфатные рН 6,0-8,0;

щелочной области рН 8,0-11,0. При этих рН АДГ пырея ползучего связывает глицин/NaOH рН 8,5-11,0. Концентрации: этанол - 1,2-40,0 мМ, ацетальдегид NADН в 2-4 раза лучше NAD, а ацетальдегид в 2-3 раза 0,8-16,0 мМ, NAD - 1,44 мМ, NADН - 0,45 мМ, АДГ пшеницы - 0,42 мкМ, АДГ эффективнее этанола. АДГ пшеницы в этой области рН NADН и ацетальдегид пырея ползучего - 0,2-0,56 мкМ.

практически вообще не связывает (табл. 1).

Показано, что оптимумы каталитических констант пырея ползучего. Последнее, вероятно, определяет повышенную легкость алкогольдегидрогеназ пырея ползучего и пшеницы в реакции окисления этанола выхода семян пшеницы из состояния покоя по сравнению с семенами пырея находятся в области рН 8,0 - 11,5 (рис. 1, кривые 2, 3) с различиями в величинах ползучего.

k(кат1) в 3-4 раза. В реакции восстановления ацетальдегида АДГ пшеницы имеет АДГ пшеницы и пырея ползучего в реакции окисления этанола имеют оптимум k(кат2) при рН 6,5-7,0, а АДГ пырея ползучего при рН 8,0-9,5 (рис. 1, температурный оптимум в диапазоне 40-50оС (рис. 2) с разницей максимальных кривые 1, 4). Причем, если соотношение k(кат2)/k(кат1) АДГ пырея ползучего значений k(кат1) в 3,2-3,5 раза. В реакции восстановления ацетальдегида АДГ равно 5-6 во всем физиологическом интервале рН (6,0-8,0), то у АДГ пшеницы пшеницы имеет температурный оптимум k(кат2) в диапазоне 55-60оС (рис. 3), оно постепенно понижается приобретая следующие значения при рН 6,0 12-14, тогда как АДГ пырея ползучего - при 40-50оС. Причем величины каталитических рН 7,0 - 4-5 и рН 8,0 - 0,1-0,2. Это указывает на то, что за счет особенностей констант (k(кат2)) АДГ пшеницы по ацетальдегиду во всем изученном интервале строения каталитического участка активного центра АДГ семян пырея температур были в 2-10 раз выше, чем у пырея ползучего.

ползучего во всем интервале рН от 6,0 до 9,5 равновесие в системе спирт Интересно отметить, что в области низких положительных температур альдегид смещено в сторону этанола, тогда как в семенах пшеницы при рН 8,(<10оС) величины k(кат2) АДГ пшеницы и пырея ползучего сближаются, а равновесие алкогольдегидрогеназной реакции смещено в сторону образования значения k(кат1) АДГ пшеницы остается в 2,5-4,5 раза выше k(кат2) АДГ пырея альдегида, содержание которого определяет, по-видимому, глубину ползучего. Это, вероятно, связано с тем, что при низких положительных гипобиотического состояния семян. Однако при подкислении среды до рН 6,температурах для обеспечения покоя и сохранения потенциальной равновесие алкогольдегидрогеназной реакции начинает смещаться в сторону жизнеспособности и тех и других семян необходимо не только накопление образования этанола. При этом в семенах пшеницы это происходит в этанола, но и поддержание определенной концентрации ацетальдегида, тем 2-2,5 раза быстрее, чем в семенах Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 495 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2001/044.pdf -19- -20обработки семян различными концентрациями этанола и ацетальдегида на их жизнеспособность и устойчивость к стрессирующим факторам среды.

kcat, мин-kcat, мин-С помощью 10 мМ растворов этанола мы предприняли попытку вывести из состояния покоя семена пшеницы сорта Якутянка 224, жизнеспособность которых по тетразолиевому методу была 100, а лабораторная всхожесть - 68%.

Испытывались методы замачивания семян в 10 мМ растворе этанола при 4 и 20оС с последующим выдерживанием на воздухе при 4оС. Лучшие результаты, всхожесть 100%, были получены при инкубации семян 15 ч в 10 мМ растворе этанола при 4оС с последующим выдерживанием их на воздухе 4,5 ч также при 4оС. То есть в этом случае этанол усилил эффект холодовой стратификации семян.

Семена пырея ползучего, относящегося к дикорастущим злакам, могут находиться длительное время в состоянии послеуборочного покоя. Они имели высокую жизнеспособность (77+3%), но низкую всхожесть (12+2%). При замачивании в 10 мМ растворе этанола при комнатной температуре всхожесть to,C to,C семян увеличивалась в 1,5 раза, а дополнительное выдерживание их при Рис.2.Температурные зависимости kcat Рис.3.Температурные зависимости температуре 4 - 5оС повышало всхожесть в 2,5 раза.

реакции окисления этанола алкоголь- kcat реакции восстановления ацетальТаким образом, малые концентрации этанола могут активизировать дегидрогеназами семян пшеницы (1) и дегида алколгольдегидрогеназами ростовые процессы и увеличивать всхожесть жизнеспособных семян как пырея ползучего (2). Условия: 0,1 М семян пшеницы (1) и пырея ползукультурных, так и дикорастущих растений.

глицин/NaOH буфер pH 10,0. Этанол- чего (2). Условия: 0,1 М Na-фосфатВыявив на физиологическом уровне положительное влияние низких 16,4 мМ, NAD-1,44 мМ, АДГ пшени- ный буфер pH 7,0. NADH - 0,45 мМ, концентраций этанола и ацетальдегида на жизнеспособность и всхожесть цы - 0,11 мкМ, АДГ пырея ползучего - ацетальдегид-4,0 мМ, АДГ пшеницы семян, мы попытались изучить некоторые биохимнческие механизмы этого 0,4 мкМ, 0,59 мкМ, АДГ пырея ползучего явления.

0,58 мкМ Если подойти к вопросам сохранения и повышения жизнеспособности семян растений с позиций биоэнергетики, то можно предположить, что большей, чем меньше степень гипобиоза семян. Таким образом, при низких жизнеспособность семян базируется на сохранении на оптимальном уровне положительных температурах для поддержания покоя семенам необходим не активности катаболических дегидрогеназных и аэробных систем. Поэтому мы ацетальдегид, а преимущественно этанол, который обеспечивает изучили изменения активности ряда ключевых дегидрогеназ и пероксидазы на продолжительность гипобиотического состояния в этих условиях.

ранних этапах прорастания семян, при длительном хранении и влияние на них Существенная разница в k(кат2) реакции восстановления ацетальдегида различных экзогенных концентраций этанола и ацетальдегида.

алкогольдегидрогеназой пшеницы и пырея ползучего при температурах от 5 до В покоящихся семенах пшеницы активности АДГ и пероксидазы 60оС позволяет предположить, что при более эффективном связывании соизмеримы (рис. 4). При прорастании семян с появлением корней и побегов ацетальдегида АДГ пырея ползучего скорость его превращения в активном активность АДГ резко снижается к шестому дню практически до нуля, а центре фермента (в особенности при низких температурах) в 5-10 раз активность пероксидазы повышается в надземной части в 1,8-2,0, в корнях в 12медленнее, чем АДГ пшеницы. Это позволяет накапливать ацетальдегид в 14, а в зерне в 4-5 раз.

семенах пырея в большей степени, чем в семенах пшеницы, что, по-видимому, В покоящихся семенах пшеницы сорта Скороспелка улучшенная урожая определяет более высокую степень гипобиоза семян пырея, меньшую скорость разных лет изучены активности не только пероксидазы и АДГ, но и некоторых их прорастания, зато повышает их адаптивный потенциал.

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 10 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»