WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 10 |

анаэробные, что будет проявляться в углублении покоя семян и понижении Разработан высокочувствительный и селективный метод спектрофотовсхожести. Тогда как низкие концентрации субстратов пероксидазы при их метрического титрования активных центров алкогольдегидрогеназы ртуть Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 488 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2001/044.pdf -5- -6содержащими соединениями (HMB, CMB), для исследования функциональной роли SН-групп в механизме действия фермента. обеспечивается за счет поддержания высокой активности ферментов Предложено использовать при проведении лабораторных исследований анаэробных процессов, а выход из состояния покоя обусловлен активацией усовершенствованные способы определения содержания сердечных гликозидов ферментов аэробных процессов, среди которых инициирующая роль пикратом натрия (заявка на изобрет. N 95115784), концентрации малонового принадлежит пероксидазе; продукты окисления фермента могут активизировать диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты (патент РФ N 2112241, процессы ПОЛ, вследствие этого возрастает интенсивность дыхания, а, общего содержания антиоксидантов в биологическом материале (патент РФ N следовательно, реализуется выход системы из состояния покоя. 3. Компоненты 97111918), общей антиокислительной активности (патент РФ N97111917)), антиокислительной системы принимают непосредственное участие в механизмах содержания флавоноидов в биологическом материале (патент РФ N 97111921) и формирования гипобиотических состояний, а их взаимное влияние, антиокислительной активности биологического материала (заявка на изобрет. N обеспечивает поддержание нормальной жизнедеятельности семян в состоянии 96114003). покоя, при прорастании и при действии на них стрессирующих факторов.

Разработаны эффективные способы иммобилизации биологически Апробация работы. Основные положения диссертационной работы активных веществ экстрактов растений на биогенном носителе (патент РФ N докладывались и обсуждались на международных, всероссийских и 2112241 и заявка на изобрет. N 97104995). республиканских съездах, симпозиумах и конференциях: IV Всесоюзном Материалы научных исследований использованы при создании биохимическом съезде (Ленинград, 1979), III Всесоюзном научном симпозиуме простого, чувствительного и специфического метода определения этанола в "Получение и применение иммобилизованных ферментов в научных биологических жидкостях и выдыхаемом воздухе на основе выделенного и исследованиях, промышленности и медицине" (Ленинград, 1980), III стабилизированного препарата алкогольдегидрогеназы из семян пшеницы Всесоюзной конференции по химии и биохимии порфиринов" (Самарканд, (а.c.CCCР, N 1666956). 1982), IV Всесоюзном симпозиуме "Инженерная энзимология" (Киев, 1983), Для сельскохозяйственного производства предложены два способа XI Всесоюзном симпозиуме "Биологические проблемы Севера" (Якутск, 1986), консервации эерна на фураж (патенты РФ N 2111677, N 2111676), способ Международном конгрессе ИСТА (Новосибирск, 1990), Первой международной консервации кормов двухуглеродными соединениями (патент РФ N 1800954) и конференции "Знание - на службу нуждам Севера" (Якутск, 1996), II съезде четыре способа консервации пантов оленя органическими соединениями Биохимического общества (Москва, 1997); Международном симпозиуме (патенты РФ N 95121681, N 95121684, N 95121119 и N 96104419), которые "Химия и химическое образование АТР, 21 век" (Владивосток, 1997);

обеспечивают длительное сохранение в зерне, зеленой массе и в пантах Межвузовских конференциях преподавателей физиологии и биотехнологии северного оленя функционально активных веществ. растений (Москва, МСХА, 1994, 1997); региональной научной конференции Предложено для повышения урожайности зерновых культур насыщать "Северо-восток России: проблемы экономики и народонаселения" (Магадан, семена различными ксенобиотиками, что способствует повышению их посевных 1998), II и III Циркумполярных сельскохозяйственных конференциях (Тромс, качеств и сопротивляемости семян и растений к экзогенным патогенным Норвегия, 1995; Анкоридж, Аляска, США, 1998), IV и V Международных факторам (действию низкой и высокой температуры, микробам и др.). Выявлена конференциях "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, МСХА, 1997, наиболее оптимальная продолжительность замачивания семян в растворах БАВ 1999), IX Международном симпозиуме по новым кормовым растениям - четыре часа. Замачивание семян в течение этого времени не наносит им (Сыктывкар, 1999), 6-и региональных конференциях, теоретических семинарах существенного вреда и не влияет на посевные качества. Обработка семян Якутского института биологии, Якутской государственной пшеницы биологически активными веществами в первые два часа способствует сельскохозяйственной академии.

повышению их всхожести. Полученные результаты могут быть рекомендованы Публикации. По теме диссертации опубликовано 88 печатных работ, в том для практического использования в сельскохозяй-ственном производстве для числе 31 статья, 15 патентов, 3 положительных решения на заявки и учебное повышения сопротивляемости семян и проростков пшеницы к действию пособие. Материалы легли в основу шести научных отчетов.

неблагоприятных факторов среды и урожайности. Объем и структура работы. Диссертационная работа представляет собой Результаты исследований отражены в учебных пособиях, которые рукопись, изложенную на 468 страницах машинописного текста, включает используются при чтении лекционного курса и при проведении лабораторно- таблиц, 93 рисунка, а также список цитируемой литературы из практических занятий по предмету "Биологическая химия", проводимых в наименований. Диссертация состоит из введения, 10 разделов, заключения, Якутской государственной сельскохозяйственной академии. выводов и приложения.

Защищаемые положения. 1. Молекулярные механизмы, заложенные в Список используемых сокращений. АДГ - алкогольдегидрогеназа, АО структуре ферментов (пероксидаза, алкоголь- и глюкозо-6-фосфат- антиоксиданты, АК - аскорбиновая кислота, АОА - антиоксидантная активность, дегидрогеназы), обуславливают их избирательное участие в механизмах АОС - антиокислительная система, Г6ФДГ - глюкозо-6формирования гипобиотических состояний. 2. Состояние гипобиоза Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 489 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2001/044.pdf -8-7экстракта, 0,1 мл 25 мМ раствора о-фенантролина, а затем после перемешивания фосфатдегидрогеназа, ИЦДГ–NADP - изоцитратдегидрогеназа NADP-зависимая, по каплям приливали 0,3 мл 123 мМ раствора FeCl3 и выдерживали в темноте ИУК - индолил-3-уксусная кислота, ОДН - о-дианизидин, СMB -хлор- и HMB - мин. Оптическую плотность измеряли при 505 нм. Для построения гидроксимеркурибензоат, G6P - глюкозо-6-фосфат, ПОЛ -перекисное окисление калибровочного графика использовали кверцетин. Количество антиоксидантов, липидов, ПО - пероксидаза, СГ - сердечные (стероидные) гликозиды, МДА - содержащихся в проростках, рассчитывали в мг/г сухой массы.

малоновый диальдегид, ТБК -тиобарбитуровая кислота, УФ - ультрафиолетовое Концентрацию пероксидазы определяли спектрофотометрически по излучение, СФ - строфантин.

поглощению при 403 нм (=102 мМ-1 см-1 (Ogewa et al., 1979) или с Материал и методы исследования использованием пиридингемохромогена (Falk, 1964).

Основными объектами исследований служили различные по Хроматографию нативной и модифицированной пероксидазы на СМпроисхождению семена пшеницы (Triticum aestivum L.) и травянистые растения, целлюлозе проводили, нанося 5 мл раствора фермента (1 мг/мл) в 5 мМ Nавыращенные в разные годы в условиях Республики Саха (Якутия) (опытные поля ацетатном буфере (рН 5,0) на колонку с СМ-целлюлозой (1Х12 см), ИБПК СО РАН и Якутского НИИСХ).

предварительно уравновешенную тем же буфером. Элюцию проводили в Влажность, всхожесть, жизнеспособность семян злаковых культур линейном градиенте концентрации ацетатного буфера (рН 5,0) от 0,005 до 1,5 М определяли по методам Гостстандартов СССР: всхожесть - ГОСТ 12038 - 66;

(объем смесителя 100 мл, скорость злюции 22 мл/ч).

жизнеспособность - ГОСТ 12039-66; сила роста - ГОСТ 12040-66; влажность Активность нативной и модифицированной пероксидазы определяли при ГОСТ 12041-66 и бобовых (караганы древовидной) - (ГОСТ 13056.6-75).

22оС по начальной скорости окисления в их присутствии о-дианизидина Жизнеспособность семян исследовали тетразольно - топографическим методом перекисью водорода (Лебедева и др., 1977). К 2,1 мл 0,01 М Nа-фосфатного (Методические указания по определению жизнеспособности семян тетразольно- буфера, содержащего 0,1 М КNO3 (рН 7,0), добавляли 0,2 мл 5 нМ раствора топографическим методом. Л.:ВИР, 1980).

пероксидазы и 0,1 мл 0,43 мМ о-дианизидина в 96%-ном этаноле. Реакцию Семена пшеницы (Triticum aestivum L.), овса (Avena L.), ячменя (Hordeum инициировали введением 0,1 мл 16 мМ Н2О2. Окисление о-дианизидина L.) и караганы древовидной (Caragana arborescens Lam.) предварительно регистрировали по увеличению поглощения раствора при 460 нм (=30 мМ-1 смзамачивали в растворах БАВ в течение 24 ч, а затем проращивали на ). За единицу активности фермента принимали его количество, окисляющее фильтровальной бумаге в чашках Петри. Число семян в одной чашке - 100, число мкмоль о-дианизидина за 1 мин.

повторностей в каждом варианте - 4, число опытов - 4.

Реакцию окисления АК (2,2-352,0 мкМ) и гидрохинона (1,0-1,6 мМ) Перекисное окисление липидов в семенах индуцировали полным светом перекисью водорода (0,64 мМ) проводили при 25оС в среде 0,1 М натрийртутно-кварцевой лампы БНПО2-30-001У3,5 ("Спектр-2", Россия) с ацетатного, рН 4,0-6,0, или натрий-фосфатного, рН 6,0-8,0, буферов, в интенсивностью энергетического облучения 30 Вт/м2, расположенной на присутствии пероксидазы хрена. Окисление АК регистрировали по уменьшению расстоянии 25 см от облучаемого объекта (max=254 нм).

поглощения при 265 нм, =7,0 мМ-1 см-1 (Досон и др., 1991), а гидрохинона при Для анализа продуктов ТБК 1 г сырой массы проростков 290 нм, =2,2 мМ-1 см-1. За единицу активности фермента принимали его гомогенизировали в фарфоровой ступке с 3 мл 50%-ного этанола, полученный количество, окисляющее 1 мкмоль субстрата (аскорбиновой кислоты или гомогенат центрифугировали 10 мин при 7000 g.

гидрохинона) за 1 мин.

За накоплением продукта перекисного окисления липидов - малонового Активность АДГ в прямой реакции определяли по скорости окисления диальдегида - следили по реакции с тиобарбитуровой кислотой при 532 нм, этанола и образования NADH при 340 нм (=6,22 мМ-1см-1). К 2,2 мл 0,1 М =155 мМ-1 см-1 (Владимиров, Арчаков, 1972) с нашими модификациями. К 0,глицин-NaOH буфера рН 10 добавляли 0,1 мл 36 мМ раствора NAD и 0,1 мл 0,мл экстракта последовательно добавляли 0,5 мл 1%-ного раствора тритона ХМ раствора этанола. Реакцию инициировали введением 0,1 мл 2,5 мкМ раствора 100, 0,2 мл 0,6 М раствор НСl и 0,8 мл 0,06 М рабочий раствор ТБК. Смесь АДГ. Активность АДГ в реакции восстановления ацетальдегида наблюдали при нагревали в кипящей водяной бане в течение 10 мин. Реакцию останавливали 340 нм по убыли NADН в процессе реакции. В кювету вносили 2,2 мл 0,1 М путем охлаждения пробы при температуре 15оС в течение 30 мин. Для Na-фосфатного буферa, рН 6,0, добавляли 0,1 мл стабилизации окраски добавляли 0,2 мл 5 мМ раствор трилона Б и 5-10 мл раствора NADН 11,3 мМ и 0,1 мл 2,5 мкМ фермента. Реакцию инициировали 0,96%-ного этанола. Оптическую плотность измеряли при 532 нм. Контрольные мл 0,1 М раствора ацетальдегида. За меру активности фермента принимали пробы инкубировали параллельно с опытными, в которые добавляли вытяжку и количество микромолей NADН, восстановленного или окисленного за 1 мин.

ТБК. Содержание МДА в проростках выражали в мкмоль/г или нмоль/г сухой Активности NADP-зависимой изоцитратдегидрогеназы, глюкозо-6массы.

фосфатдегидрогеназы и дегидрогеназы 6-фосфоглюконовой кислоты определяли Определение антиоксидантов проводили по методике (Ермаков, 1987). В по (Путилина, 1982), содержание стероидных гликозидов – по пробирку последовательно вносили 2,2 мл 50%-ного этанола, 0,4 мл Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 490 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2001/044.pdf -9- -10 (Ермаков, 1987), аскорбиновой кислоты - по (Полевой, Максимова, 1978). соединениям относятся аскорбиновая кислота, кверцетин, гидрохинон, Концентрацию АДГ находили спектрофотометрически по спектру стероидные гликозиды, ИУК.

поглощения комплекса фермента с NAD в присутствии пиразола (Einarsson et al., Показано, что аскорбиновая кислота является медленно окисляемым 1976) или с помощью титрования хлор- и гидроксимеркурибензоатом (Рогожин субстратом пероксидазы. В механизме пероксидазного окисления аскорбиновой и др., 1988). кислоты заложен сложный регуляторный механизм, имеющий биологическое Спектральные измерения выполняли на двухлучевом спектрофотометре значение. Установлено, что при связывании двух молекул АК процесс DMS 100 S фирмы "Varian" (США). Кажущиеся константы скорости реакций пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты будет ускоряться, а избыток окисления субстратов пероксидазы, АДГ и Г6ФДГ определяли из данных по АК понижает каталитическую активность фермента.

стационарной кинетике (Березин, Клесов, 1976). Исследованные антиоксиданты (дигоксин, гидрохинон, кверцетин и При расчете каталитических констант использовали пакет прикладных аскорбиновая кислота) могут ингибировать пероксидазное окисление быстро программ по анализу и обработке кинетических данных ферментативных окисляемого субстрата о-дианизидина, катализируемое пероксидазой хрена.

реакций. Все полученные количественные результаты подвергнуты Дигоксин связываясь с фермент-субстратным комплексом, в котором статистической обработке с учетом критерия Стьюдента при р<0,05-0,01. образуется стабильный полуокисленный продукт о-дианизидина, ингибирует Статистическую ошибку средней определяли по методике (Лакин, 1990), пероксидазу по антиконкурентному типу. Проявляя свойства антиоксиданта используя ППП Снедекор V2. дигоксин подавляет свободнорадикальное окисление о-дианизидина. Кверцетин ингибирует пероксидазу по смешанному типу. При связывании с ферментом РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ кверцетина понижается сродство и эффективность превращения о-дианизидина.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 10 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»