WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 ||

Было проведено исследование взаимодействия L-HEP и L-BEP с другими пептидами, в частности, AAFR и AALR. Наблюдалась незначительная разница в энергии нековалентных взаимодействий пептидов с ферментами, которая, тем не менее, не объясняет полностью различие в скоростях гидролиза этих субстратов с помощью L-HEP и L-BEP. Длинные гидрофобные боковые цепи фенилаланина и лейцина примерно одинаково располагаются по отношению к субстрат-связывающим центрам ферментов человека и быка: вблизи гидрофобной части боковой цепи Lys99. Наиболее вероятная причина наблюдаемой разницы в константах специфичности L-HEP и L-BEP по отношению к этим субстратам – это большая приспособленность L-HEP к гидролизу амидной связи вне зависимости от Р2-Рn остатков субстрата.

Получение и исследование каталитических свойств мутантных вариантов L-HEP с заменами R96K, K219Q и R96K/K219Q.

Мутации в ген L-HEP были введены с помощью сайт-направленного мутагенеза.

Экспрессию гибридных белков, ренатурацию и очистку мутантных вариантов фермента проводили с помощью процедур, используемых для L-HEP. Тиоэфир Z-Lys-SBzl, как и ожидалось, гидролизовался всеми тремя мутантами с теми же кинетическими параметрами, что и в случае L-HEP. При расщеплении специфического пептидного субстрата GD4K-na наблюдалась другая картина (таблица 6). Мутации K219Q и R96K/K219Q приводили к понижению по сравнению с L-HEP констант специфичности в 1.76 и 2.4 раза, соответственно, сохраняя, тем не менее, преимущество над L-BEP (5- и 4-кратное, соответственно). Ухудшение происходило преимущественно за счет уменьшения константы Михаэлиса, отвечающей за связывание субстрата. Это соответствует результатам моделирования, предполагающим, что при вхождении молекулы GD4K-na в щель активного центра L-HEP устанавливается электростатическое взаимодействие между положительно заряженной боковой цепью Lys219 и отрицательно заряженными P3-Р5, отсутствующее в случае L-BEP.

Таблица 6. Сравнение кинетических параметров L-HEP, L-BEP и L-HEP/R96K, LHEP/K219Q и L-HEP/R96K/K219Q. Значения констант представлены как средние ± среднеквадратичное отклонение, исходя из трех независимых измерений.

Z-Lys-SBzl, в 0.1 М Tris-HCl, GD4K-na, в 25 mM Tris-HCl, pH 8.0 0.1 мМ CaCl2, pH 8.Фермент kcat/Km, с-1 kcat/Km, с-kcat, с-1 Km, мкМ мМ-1 kcat, с-1 Km, мкМ мМ-L-HEP 133 ± 3 140 ± 7 950 ± 50 117 ± 8 42 ± 3 2790 ± L-HEP/R96K 121 ± 3 115 ± 5 1050 ± 50 115 ± 5 40 ± 3 2875 ± L-HEP/K219Q 131 ± 4 121 ± 8 1080 ± 70 145 ± 10 92 ± 8 1580 ± L-HEP/R96K/K219Q 140 ± 5 135 ± 8 1040 ± 60 102 ± 7 88 ± 8 1160 ± L-BEP 129 ± 4 120 ± 10 1075 ± 70 47 ± 4 160 ± 10 295 ± Рисунок 8. Картина расщепления cлитного белка Trx/hEGF под действием L-BEP, L-HEP и ее мутантных вариантов.

А. Титрование расщепления cлитного белка Trx/hEGF. В реакционную смесь, содержащую мкг гибридного белка, добавляли различные количества L-BEP, L-HEP, L-HEP/R96K и LHEP/K219Q (0.0003, 0.001 и 0.003 ед.ак. по Z-Lys-SBzl) и инкубировали в течение 16 ч при комнатной температуре.

Б. Кинетика расщепления гибридного белка Trx/hEGF с помощью L-HEP и L-HEP/R96K/K219Q.

Для электрофореза отбирались пробы инкубации 15 мкг гибридного белка с 0.001 ед. акт. в течение 30 мин, 1, 2, 4, 8 и 16 ч.

Остатки Asp-P2 и Asp-P4 также могли бы усиливать связывание субстрата с ферментом за счет более сильной связи с Arg96, чем с Lys96. Однако, судя по сохранению мутантным вариантом R96K полной активности L-HEP по расщеплению GD4K-na, эта разница не сказывается ни на Km, ни на kcat. Этот результат можно объяснить тем, что Lysпредположительно связывает не взаимодействующие с другими остатками фермента Asp-P3 и Asp-P5, в то время как Arg96 взаимодействует с уже связанными с Lys99 Asp-P2 и Asp-P4. Сохранение у мутантов высокой каталитической константы может быть объяснено отличием L-HEP и L-BEP не в центрах связывания субстрата, а в элементах активных центров, участвующих непосредственно в разрезании пептидной связи (включая остатки каталитической триады и амидные группы, стабилизирующие оксианион субстрата). Это предположение подтверждается тем фактом, что одинаковая гидролитическая активность у ферментов быка и человека наблюдается только при расщеплении тиоэфира Z-Lys-SBzl, тогда как все проверенные субстраты с амидной связью лучше гидролизует фермент человека.

Иная ситуация наблюдается при расщеплении мутантными вариантами L-HEP гибридных белков с сайтами узнавания энтеропептидазы (рисунок 8). L-HEP/R96K, L-HEP/K219Q и L-HEP/R96K/K219Q расщепляли гибридный белок Trx/hEGF приблизительно так же эффективно, как и L-HEP. Предполагается следующая причина нечувствительности гидролиза гибридных белков к мутациям в субстратсвязывающем центре L-HEP. Конформация участка гибридного белка, связывающегося с L-HEP в данном случае такова, что либо взаимодействие субстрата с боковой цепью остатка 219 фермента отсутствует, либо влияет на связывание/расщепление незначительно. Это можно объяснить более жесткой, чем в GD4K-na, структурой пептидной цепи субстрата, ограничивающей возможные конформации сайта DDDDK энергетически выгодными для соседних с ним участков гибридного белка.

Показательный результат влияния исследуемых остатков на ферментативный катализ был получен в опытах неспецифического расщепления белков TRAIL и BSA по сайтам QEEIKEN и DEHVKLV, соответственно, где отрицательно заряженные боковые Рисунок 9. Гидролиз белков TRAIL и BSA под действием L-BEP, L-HEP и ее мутантных вариантов R96K, K219Q и R96K/K219Q.

A. TRAIL: Дорожка 1– контроль, 15 мкг TRAIL без добавления фермента; дорожки 2-6 – результаты инкубирования смеси, содержащей 15 мкг TRAI с 0.1 ед.ак. L-BEP, L-HEP, R96K, K219Q и R96K/K219Q, соответственно, в течение 24 ч при 25° С.

Б. BSA: Дорожка 1 - контроль (20 мкг БСА без фермента); дорожки 2-6 - результаты инкубирования смеси, содержащей 20 мкг БСА с 1 ед.ак. (по Z-Lys-SBzl) L-BEP, L-HEP, R96K, К219Q и R96K/К219Q, соответственно, в течение 24 ч при 25° С.

цепи отсутствуют в Р2 и в Р2-Р3 положениях. В обоих случаях мутанты с одиночными заменами и, особенно, с двойной менее активно расщепляли белки по этим сайтам, значительно приблизившись в этом отношении к легкой цепи энтеропептидазы быка (рисунок 9). Результаты моделирования взаимодействия пептида EEIK с L-HEP предполагают, что в случае TRAIL любой из пары Arg96/Lys219 улучшает связывание белкового субстрата с ферментом, поэтому, хотя одиночные замены дают незначительное падение неспецифического гидролиза TRAIL, двойная замена значительно увеличивает специфичность фермента. В случае BSA основное понижение активности происходит при замене Arg96Lys. Видимо, Arg96 «отталкивает» Val-P2 от петли 96-99, способствуя образованию антипараллельной -структуры между субстратом и петлей 216-220. Также можно предположить, что в случае лизина-96 образуется участок энергетически невыгодного интерфейса между ферментом и субстратом, обусловленный большей концентрацией положительного заряда возле гидрофобной боковой цепи Val-P2. Сама по себе замена Lys219Gln незначительно уменьшает гидролиз BSA энтеропептидазой, однако при двойной замене наблюдается кооперативный эффект. Можно сделать вывод, что в данном случае Arg96 способствует образованию выгодной для гидролиза конформации субстрата в активном центре энтеропептидазы, а Lys219 лишь закрепляет ее.

Данные результаты, с одной стороны, говорят о важности остатков 96 и 219 для гидролиза пептидных субстратов, а, с другой стороны, обосновывают различие каталитических параметров ферментов быка и человека, главным образом, не отличающимися S2-S5 сайтами связывания, а различиями в самой каталитической машине. Последние могут включать в себя различия в пространственном размещении остатков каталитической триады и ее расположение по отношению к оксианионной дыре и S1 сайту. Именно они могут позволить L-HEP с большей (по сравнению с L-BEP) скоростью расщеплять амидные субстраты, которые значительно более требовательны к механике фермента, чем сложные эфиры и тиоэфиры.

Для проверки этого предположения было решено провести сравнение каталитических параметров гидролиза Р1-субстратов, содержащих в месте гидролиза тиоэфирную или амидную связь. В качестве амидного субстрата были протестированы лизин- и аргинин-паранитроанилиды, однако ни один из них не гидролизовался со скоростью доступной для спектрофотометрической детекции. Этот результат предполагает, что конформация такого субстрата в связанном состоянии не позволяет ферменту провести гидролиз амидной связи. Причиной этого может быть только необходимость существования амидного субстрата в некой напряженной конформации, для которой необходимо присутствие Р2-Рn остатков. Учитывая тот факт, что энтеропептидаза расщепляет не только специфические субстраты с аспартатами в этих положениях, но и различные другие субстраты (табл. 5), можно сделать вывод, что критическим для создания подобной конформации является установление определенного набора водородных связей между основной цепью субстрата и фермента. Такие водородные связи (подобные наблюдающимся в антипараллельной -структуре) показаны как для кристаллической структуры комплекса легкой цепи энтеропептидазы быка с ингибитором-аналогом активационного пептида трипсиногена, так и при моделировании динамики взаимодействия L-BEP, L-HEP и ее мутантных вариантов с пептидными субстратами. В связи с тем, что участок 216-220 более стабилен, чем лабильная петля 96-99, выравнивание субстрата происходит именно по нему, а положительно заряженные остатки, окружающие щель активного центра, в большей степени фильтруют субстраты и стабилизируют необходимую для гидролиза конформацию комплекса фермент/субстрат.

Выводы.

1. Синтезирован ген каталитической субъединицы энтеропептидазы человека (LHEP) и осуществлена ее экспрессия в Escherichia coli в составе гибридного белка с тиоредоксином в качестве белка-носителя.

2. Разработана процедура ренатурации гибридного белка тиоредоксин/L-HEP, позволяющая получать до 10 мг активного фермента с литра культуры.

3. Впервые охарактеризованы ферментативные свойства легкой цепи энтеропептидазы человека. Определены кинетические параметры L-HEP по гидролизу пептидных субстратов и гибридных белков, содержащих сайт узнавания энтеропептидазы DDDDK. Обнаружено, что константа специфичности (kcat/Km) LHEP при гидролизе подобных субстратов на порядок превышает константу специфичности L-BEP.

4. Показано, что взаимодействие L-HEP с ингибиторами проходит по типу трипсинподобных сериновых протеиназ. Показано, что ионы одно- и двухвалентных металлов (Na+, Ca2+) ингибируют гидролиз специфических субстратов. Изучение влияния денатурирующих агентов на L-HEP показало ее высокую стабильность.

5. Построена пространственная модель L-HEP. С помощью молекулярного моделирования найдена мутация C122S, введение которой в L-HEP повышает выход ренатурации в 4 раза. Показана критичность образования дисульфидной связи 136-201 для рефолдинга L-HEP.

6. Обнаружена вторичная специфичность L-HEP по отношению к хромогенным субстратам и белкам, содержащим в положении Р2 ароматические и большие гидрофобные боковые цепи. Показано, что L-HEP расщепляет белковые субстраты, даже если в сайте связывания субстрата в позициях Р2-Р5 содержится менее 4-х остатков с отрицательно заряженными боковыми цепями (Asp/Glu).

7. С помощью методов молекулярного моделирование показано, что аминокислотные остатки в положениях 96 и 219 отвечают за различия каталитических свойств легких цепей энтеропептидаз быка и человека. Показано, что введение в L-HEP мутаций R96K и K219Q улучшает специфичность белка, практически не меняя скорость гидролиза специфических субстратов.

8. Показан кооперативный эффект улучшения специфичности при одновременном введении мутаций R96K и K219Q в L-HEP. Неспецифическое расщепление белков TRAIL и BSA по сайтам QEEIK и DEHVK значительно уменьшается при использовании мутантного варианта L-HEP/R96K/K219Q, по сравнению с диким типом и вариантами с одиночными заменами R96K и K219Q.

Материалы диссертации изложены в следующих работах:

1. Гаспарян М. Э., Остапченко В. Г., Шульга А. А., Долгих Д. А. Синтез гена и экспрессия в E. coli каталитической субъединицы энтеропептидазы человека.

Международный конгресс «Пиридоксальфосфат-зависимые ферменты:

структура, молекулярная патология и медицина», Москва, май 2002, сборник трудов, стр. 58.

2. Остапченко В. Г., Гаспарян М. Э., Долгих Д. А. Экспрессия рекомбинантной каталитической субъединицы энтеропептидазы человека в E. coli и характеризация ее ферментативной активности. XV зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 10-14 февраля 2003, сборник тезисов, стр. 7.

3. Marine E. Gasparian, Valeriy G. Ostapchenko, Alexey A. Schulga, Dmitry A. Dolgikh, and Mikhail P. Kirpichnikov. Expression, purification and characterization of human enteropeptidase catalytic subunit in Escherichia coli. Protein Expression & Purification, 31/1, September 2003, pp. 133-139.

4. V.G. Ostapchenko, M.E. Gasparian, D.A. Dolgikh. Production in E. coli and investigation of recombinant catalytical cubunit of human enteropeptidase. FEBS Forum For Young Scientists, Warsaw, June 24-26 2004,

Abstract

book, p. 27.

5. M. E. Gasparian, V. G. Ostapchenko, D. A. Dolgikh and M. P. Kirpichnikov Kinetic characterization of recombinant human enteropeptidase light chain and its mutant C122S.

the FEBS Journal, vol. 272, suppl. 1, July 2005. 30th FEBS Congress “The Protein World”, abstracts, p. 168.

6. Гаспарян М. Э., Остапченко В. Г., Долгих Д. А., Кирпичников М. П.

Биохимическая характеристика рекомбинантной легкой цепи энтеропептидазы человека. Биохимия, 2006, том 71, вып. 2, с. 149 – 7. Остапченко В. Г., Гаспарян М. Э., Долгих Д. А. Исследование вторичного центра связывания субстратов энтеропептидазы. XVIII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 7-10 февраля 2006, сборник тезисов, стр. 44.

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»