WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Мутации в гене L-HEP были проведены с помощью процедуры точечного мутагенеза. Экспрессия мутантных вариантов и их ренатурация проводилась по методикам для L-HEP. Ренатурация L-HEP/C122S дала значительно повышенный по Таблица 4. Ренатурация Trx/L-HEP и Trx/C122S и очистка активного фермента. Приведены усредненные данные пяти независимых экспериментов.

Тельца Ренатурированный и Гибридный включения со 100 мл очищенный на СИТ-агарозе Выход ренатурации, % белок культуры, мг фермент, мг Trx/L-HEP 1.1 ± 0.2 2.0 % (58.6 мг L-HEP) 100 мг Trx/C122S 4.6 ± 0.3 7.8 % (58.6 мг C122S) сравнению с L-HEP (до 8%) выход активного фермента (таблица 4). Как и в случае L-HEP было проведено тестирование ферментативных свойств и стабильности L-HEP/C122S. В случае гидролиза Z-Lys-SBzl, GD4K-na и гибридных белков наблюдалась одинаковая с LHEP активность мутанта. Кроме того, стабильность мутантного белка по отношению к денатурирующим агентам (детергенты, соли, рН, температура и др.) осталась на том же высоком уровне.

Для остальных мутантных вариантов (с заменами VRD и ARD) используемая процедура ренатурации дала количество активного фермента достаточное лишь для автокаталитического расщепления за время, в 10-20 раз превышающее аналогичное в случае L-HEP. Этот факт не позволил получить необходимые для анализа количества активных мутантных вариантов L-HEP/VRD и L-HEP/ARD.

Можно предположить несколько причин, по которым при использованной методике ренатурации не было получено достаточные количества активных ферментов LHEP/VRD и L-HEP/ARD. Основная – это то, что удаляемая дисульфидная связь может быть критически важна при фолдинге белка in vitro. Возможно, дисульфидная связь 136201 поддерживает необходимую для высокой активности напряженную внутреннюю структуру белка. Поэтому стабилизация с помощью невалентных взаимодействий может не уравновешивать дестабилизацию, обусловленную разрывом ковалентной связи. Другая предполагаемая причина – это образование растворимого белка в неактивной конформации. Ее анализ в таком случае затруднен сложностью ее очистки, так как она не связывается с СИТ-агарозой. Кроме того, судя по тому, что основная масса белка после диализа из ренатурационного буфера выпадает в осадок, выход ренатурации, очевидно, не растет, а падает.

Исследование специфичности L-HEP.

Специфичность является важнейшей характеристикой ферментов. Ранее считалось, что энтеропептидаза расщепляет пептид исключительно на С-конце последовательности DDDDK. В последнее время были зафиксированы факты гидролиза белков энтеропептидазой и в других сайтах. Предполагая существование вторичной специфичности энтеропептидазы (соответствующей другому физиологическому субстрату), а также учитывая важность высокой специфичности при расщеплении гибридных белков, было проведено подробное изучение гидролиза различных субстратов, не содержащих последовательность DDDDK, с помощью L-HEP. Для определения предпочтительных для легкой цепи энтеропептидазы человека сайтов расщепления отличных от такового в трипсиногене был проведено расщепление ряда хромогенных пептидных субстратов с остатком лизина или аргинина в положении Р1 и варьирующимися остатками в положениях Р2-Р4. Гидролиз и хромогенных трипептидов XY(R/K)-pNA и тетрапептидов XYZ(R/K)-pNA проводили по ранее описанным методикам. Было показано, что L-HEP предпочитает аргинин лизину в положении Р1, а субстраты с ароматическими или большими гидрофобными остатками в положении Ррасщепляются всего лишь в несколько раз медленнее, чем Z-Lys-SBzl (таблица 5). Было проведено сравнение специфичности легких цепей энтеропептидаз человека и быка. В качестве последней был взят препарат американской фирмы New England Biolabs, представляющий собой легкую цепь энтеропептидазы быка, экспрессированную в бактериях. Оказалось, что подобные субстраты расщепляются бычьим ферментом от 2 (в случае Z-AFR-pNA) до 5 и более раз медленнее. Как и в случае расщепления специфического субстрата GD4K-na разница обуславливается различием как в Km, так и kcat.

Таблица 5. Гидролиз неспецифических субстратов с помощью L-HEP. Значения констант представлены как средние ± среднеквадратичное отклонение, исходя из трех независимых измерений.

L-HEP L-BEP Субстрат kcat/Km, kcat/Km, kcat, с-1 Km, мкМ kcat, с-1 Km, мкМ мМ-1 с-1 мМ-1 с-Z-Lys-SBzl 133 ± 4 140 ± 7 950 ± 30 129 ± 4 120 ± 6 969 ± For-Ala-Phe-Arg-pNA 23.5 ± 0.9 76 ± 4 309 ± 11 26.3 ± 1.0 192 ± 10 137 ± Z-Ala-Phe-Arg-pNA 17.5 ± 0.7 67 ± 4 261 ± 10 19.1 ± 0.9 155 ± 8 123 ± Z-Ala-Ala-Phe-Arg-pNA 28.9 ± 2.0 110 ± 5.5 255 ± 15 28.5 ± 2.3 461 ± 20 61 ± Z-Gly-Pro-Arg-pNA 14.4 ± 0.6 91 ± 5 158 ± 7 12.5 ± 0.5 305 ± 15 41 ± For-Ala-Phe-Lys-pNA 18.2 ± 0.8 167 ± 8 109 ± 5 15.4 ± 0.5 280 ± 15 55 ± Z-Ala-Tyr-Arg-pNA 10.0 ± 0.4 109 ± 5 92 ± 5 9.3 ± 0.7 360 ± 18 28.4 ± 1.Z-Ala-Leu-Arg-pNA 15.2 ± 0.7 234 ± 11 65 ± 3 7.2 ± 0.7 640 ± 25 11.3 ± 1.Z-Ala-Trp-Arg-pNA 11.5 ± 0.5 240 ± 12 48 ± 3 9.5 ± 0.5 515 ± 20 18.5 ± 2.Z-Ala-Ala-Leu-Arg-pNA 11.6 ± 1.0 268 ± 15 42.9 ± 2.5 7.1 ± 1.0 930 ± 50 7.6 ± 1.Z-Ala-Ala-Arg-pNA 9.5 ± 0.7 356 ± 16 26.7 ± 1.6 3.3 ± 0.4 680 ± 30 4.8 ± 1.Z-Pro-Phe-Arg-pNA 6.2 ± 0.3 265 ± 13 23.4 ± 1.3 4.4 ± 0.2 720 ± 30 6.1 ± 0.Z-Ala-Met-Arg-pNA 7.6 ± 0.3 420 ± 20 18.2 ± 1.0 4.0 ± 0.2 2100 ± 90 1.9 ± 0.Неспецифический гидролиз проявлялся и при обработке энтеропептидазой гибридных белков. В частности, при расщеплении гибридного белка Trx/TRAIL наблюдалось появление посторонних продуктов расщепления. Было исследовано расщепление белков TRAIL и BSA, у которых отсутствуют специфический сайт, но есть много сайтов трипсинолиза, в том числе и с одним-двумя отрицательно заряженными остатками в позициях Р2-Р5. Результаты инкубации этих белков с L-HEP анализировали с помощью электрофореза и масс-спектрального анализа. TRAIL расщеплялся преимущественно по сайту QEEIKEN, содержащему большую гидрофобную цепь в положении Р2 и отрицательно заряженные остатки в положении Р3 и Р4 (рисунок 9А, дорожка 3). Расщепление BSA происходило преимущественно по сайту DEHVKLV, также содержащему отрицательно заряженные остатки, в этом случае в позициях Р4 и Р(рисунок 9Б, дорожка 3). Сравнение гидролиза этих белков под действием L-HEP и L-BEP (дорожки 2 и 3, соответственно, на рисунке 9) показало, что L-BEP практически не расщепляет пептиды в указанных сайтах.

Для выяснения причин, обуславливающих такое различие, было проведено моделирование взаимодействия каталитических субъединиц энтеропептидаз человека и быка с различными субстратами.

Моделирование взаимодействия активного центра энтеропептидазы с пептидными субстратами.

За основу модели комплекса фермента с субстратом был выбран комплекс легкой цепи энтеропептидазы быка с ковалентно связанным ингибитором VD4K-хлорметаном (1EKB в базе данных PDB). Первоначально в качестве субстрата было решено взять наиболее часто используемый при оценке специфической ферментативной активности энтеропептидазы пептид глицил-тетрааспартил-лизил--нафтиламид (GD4K-na). Однако, пробные запуски МД этих комплексов показали быстрое нарушение каталитически активной конфигурации активного центра энтеропептидазы, которая не восстанавливалась в течение разумного для МД эксперимента (5-15 нс) времени. Поэтому для работы был взят субстрат, содержащий, кроме остатков GD4K, изолейцин в Р1'-положении (как в трипсиногене). Для построения комплекса L-HEP с субстратом GD4KI было проведено выравнивание пространственных структур L-BEP и L-HEP. При этом молекулу ингибитора копировалась в структуру L-HEP и, с помощью модуля Builder, проводилась модификация несовпадающих фрагментов молекулы субстрата. Затем проводилась минимизация конформационной энергии комплекса с помощью процедуры, использованной при построении модели L-HEP. Аналогичным образом были получены модели комплексов L-BEP и L-HEP с пептидами AAFR, AALR и EEIK.

Анализ ближайшего окружения субстрата (10 ) позволил выделить несколько структурных различий ферментов человека и быка, способных повлиять на связывание субстрата. С помощью программы Insight II было проведено сравнение взаимодействия субстрата с остатками, находящимися в этих положениях в L-HEP и L-BEP (рисунок 6).

Анализ электростатических взаимодействий и водородных связей между ферментом и субстратом при сравнении комплексов L-HEP и L-BEP со специфическим субстратом, указывает, что остатки 96 и 219 отвечают за различие каталитических констант у ферментов быка и человека.

Стабильность полученных комплексов фермент-субстрат исследовалась с помощью метода МД. Был проведен сравнительный анализ взаимодействий L-BEP, L-HEP и ее мутантных вариантов с субстратами по структурам, извлеченным из траекторий МД.

Полученные МД траектории были проанализированы, с целью установить интервалы с относительно стабильным взаиморасположением фермента и субстрата. Оценивались расстояния между заряженными частями следующих пар остатков: Lys-P1 – Asp187, Asp-P2 – Lys(Arg)96, Asp-P2 – Lys99, Asp-P3 – Lys99/219, Asp-P4 – Lys(Arg)96/99/219, Asp-P5 – Lys219. Кроме того, в качестве параметра, характеризующего близость взаиморасположения фермент-субстрат к реакционно-способному, оценивались расстояния между O (Asp102) & N1(His57), N2(His57) & O(Ser195). Анализ случайно выбранных структур из МД траекторий показал, что в случае L-HEP и ее мутантного варианта L-HEP/R96K (имеющих в своем составе лизин-219) субстрат стремится усилить электростатические и водородные связи с ферментом, максимально приближаясь к боковой цепи лизина-219 (правда, преимущественно за счет взаимодействия не с Р3, что предполагалось из анализа комплексов до МД, а с Р4 и Р5). При отсутствии положительного заряда в данной позиции полипептидной цепи фермента (L-BEP и мутантные варианты L-HEP/K219Q и L-HEP/R96K/K219Q) отрицательно заряженные остатки Р2-Р5 ориентируются либо вдоль петли 216-220, либо возле петли 96-99, либо отклоняются в сторону петли 172-175, что стабилизируется электростатическим взаимодействием с Arg224.

Усредненные в МД энергии электростатических и Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий между остатками фермента и субстрата были оценены с помощью модуля g_nbi из пакета GROMACS на непрерывном интервале размером в 1 нс. Для этого брались точки с периодичностью 1 пс, в них вычислялась энергия невалентных взаимодействий (включая электростатические и Ван-дер-Ваальсовы взаимодействия), а на заключительном этапе вычислялось среднее арифметическое всех показаний. Подобное измерение производилось для трех независимых МД траекторий для каждой пары фермент/субстрат. По энергии взаимодействия субстрата с мутантными вариантами Рисунок 6. Сравнение пространственных структур комплексов L-BEP и L-HEP со специфическим субстратом. Модели взаимодействия энтеропептидаз со специфическим субстратом были построены на основе кристаллической структуры комплекса легкой цепи энтеропептидазы с ингибитором VD4K-cm (1EKB). При сравнении картин взаимодействий L-BEP (А) и L-HEP (Б) с остатками субстрата Р1-Р5 хорошо видны отличия, обусловленные присутствием в случае L-HEP положительно заряженного остатка лизина в положении 219 и заменой в положении 96 остатка лизина на более объемный остаток аргинина.

Рисунок 7. Комплексы энтеропептидаза/субстрат, полученные в ходе молекулярной динамики. Структуры комплексов представляют конечные точки траекторий МД. Для сравнения комплексов было произведено их выравнивание по атомам основной цепи с помощью программы INSIGHT II. Субстрат (выделен синим цветом) в случае L-HEP и L-HEP/R96K (А) ориентировался вдоль петли 216-220 (центральная нижняя часть рисунка). В случае же L-BEP, L-HEP/K219Q и L-HEP/R96K/K219Q (Б) субстрат мог занять как положение вдоль петли 216-220, так и отклоняться в сторону петель 96-99 (правый верхний угол) или 172-175 (левый верхний угол).

L-HEP/R96K и L-HEP/K219Q занимали промежуточное положение по отношению к L-HEP и L-BEP, что говорит о влиянии остатков 96 и 219 на связывание субстратов энтеропептидазой, и предполагает, что они играют большую роль в различии констант связывания субстрата X-D4K-Y энтеропептидазами человека и быка. Изменения в энергии взаимодействия с субстратом, вызванные введением в L-HEP мутаций R96K, K219Q и R96K/K219Q (с заменами остатков L-HEP на соответствующие им остатки L-BEP), обосновывают разницу в константах Михаэлиса L-HEP и L-BEP по отношению к специфическим субстратам, однако ничего не говорят о наблюдаемом различии каталитических констант L-HEP и L-BEP.

В МД экспериментах с субстратом выяснилось, что хотя структура гидрофобного ядра каталитического домена энтеропептидазы остаётся во время динамики практически неизменной, некоторые экспонированные на поверхность петлевые участки очень подвижны. В частности, это касается субстрат-связывающих регионов 96-99, 216-220. Это в определенной мере объясняет способность энтеропептидазы гидролизовать неспецифические субстраты, хотя и с меньшим сродством.

Как и в комплексах некоторых других химотрипсин-подобных сериновых протеиназ с субстратами/ингибиторами, в кристаллическом комплексе каталитической субъединицы энтеропептидазы быка с аналогом активационного пептида трипсиногена VD4K-хлорметаном наблюдается образование антипараллельной -структуры между Р1-Ростатками субстрата и 214-216 остатками фермента. При этом образование водородных связей между субстратом и ферментом не только улучшает связывание субстрата, но и в значительной мере определяет положение субстрата в активном центре. С помощью МД экспериментов было обнаружено, что большее число водородных связей между основными цепями L-HEP и GD4KI образуется в случае присутствия положительно заряженного остатка в позиции 219 фермента, взаимодействие с которым аспартатов субстрата способствует выстраиванию последнего вдоль петли 216-220 фермента и образованию между ними -структуры (рисунок 7, А). Такая картина наблюдалась во всех траекториях с участием L-HEP и L-HEP/R96K. В случае L-BEP, а также L-HEP/K219Q и L-HEP/R96K/K219Q (рисунок 7, Б) наблюдалась другая картина: N-концевая часть субстрата практически в каждой траектории располагалась по-разному по отношению к субстрат-связывающим центрам фермента. Это объясняется отсутствием преобладающего центра связывания для отрицательно заряженных остатков Asp-P4 и Asp-P5, каковым в L-HEP является Lys219.

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»