WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Оптимизация проводилась по нескольким направлениям: изменение состава буферов для ренатурации и их рН, изменение температуры и длительности различных этапов диализа и инкубации, а также изменение концентрации ренатурируемого белка на разных стадиях ренатурации. В результате выход был увеличен до 2%, и удалось получить до 10 мг активного фермента с высокой степенью чистоты с 1 л культуры клеток (таблица 4).

Исследование ферментативных свойств L-HEP.

Для характеризации каталитических свойств L-HEP был проведен традиционный для исследования трипсин-подобных сериновых протеиназ набор тестов по расщеплению субстратов и ингибированию каталитической активности. В качестве субстратов были использованы синтетические субстраты Z-Lys-SBzl (субстрат трипсина) и GD4K-na (специфический субстрат энтеропептидазы – аналог активационного пептида трипсиногена), а также гибридные белки Trx/IL13 и Trx/hEGF. Гидролиз тиоэфира Z-LysSBzl, пептидного флуоресцентного субстрата GD4K-na проводили согласно ранее описанным методикам. При гидролизе белкового субстрата его концентрация во всех случаях была в пределах 0.5-1 мг/мл, что соответствовало 15-50 мкМ. При измерении кинетических параметров ферментативная реакция гидролиза считалась соответствующей кинетике Михаэлиса-Ментен. Для расчета параметров бралось по две точки с концентрациями субстрата меньше и больше константы Михаэлиса. График зависимости скорости гидролиза от концентрации субстрата строился в двойных обратных координатах (1/V, 1/S) Лайна-Уивер-Берка (уравнение 1). Линейное приближение этой зависимости считалось с помощью программного пакета Origin 7.0 (Microcal, США).

1/V = 1/Vmax + Km/Vmax 1/S [Уравнение 1], где V – скорость гидролиза, Vmax = kcat E, Е – концентрация фермента в реакционной смеси, S – начальная концентрация субстрата в реакционной смеси.

Таблица 1. Сравнение кинетических параметров расщепления Z-Lys-SBzl и GD4K-na с помощью L-HEP и L-BEP. Величины Km и kcat выражены как среднее ± квадратичная ошибка результатов трех независимых измерений.

Z-Lys-SBzl GD4K-na kcat (c-1) Km (мM) kcat/Km (мM-1с-1) kcat (c-1) Km (мM) kcat/Km (мM-1с-1) L-HEP 133 ± 3 140 ± 7 950 ± 50 115 ± 5 0.16 ± 0.01 719 ± L-BEP 129 ± 4 120 ± 10 1075 ± 70 42.7 ± 4.0 0.61 ± 0.09 70 ± Рисунок 2. Сравнение расщепления гибридного белка Trx/hEGF с помощью L-HEP и рекомбинантной легкой цепи энтеропептидазы быка (L-BEP, New England Biolabs).

А - Отдельные пробы, содержащие 15 мкг Trx/hEGF инкубировались при 20 С в течение 20 часов в 0.1 М трисгидрохлориде, рН 8.0, 1 мМ CaCl2 и 0,1% Tween с различными количествами относительных единиц активности (определяемых как изменение поглощения при 412 нм при расщеплении Z-Lys-SBzl) L-HEP и L-BEP. Дорожка 1, проба без фермента; дорожки 2-4 и 5-соответствуют 0.0003, 0.0009 и 0.относительным единицам активности бычьей и человеческой энтеропептидаз, соответственно.

Б - пробы, содержащие 15 мкг Trx/hEGF, инкубировали при 25 °C с одинаковыми относительными единицами активности L-HEP и L-BEP (по расщеплению Z-LysSBzl) в буфере, содержащем 0.1 М TrisHCl (pH 8.0) и 0.02 мМ CaCl2, различные интервалы времени. Пробы анализировали с помощью 12%-ного трис-трицинового ДСН-электрофореза в ПААГ, и окрашивали Кумасси бриллиантовым синим.

Оценка скорости расщепления гибридных белков с сайтом узнавания энтеропептидазы проводилась с помощью сканирования на денситометре ImageMaster VDS («Amersham Pharmacia Biotech», США).

Результаты показали (таблица 1, рисунок 2), что при расщеплении тиоэфира Z-Lys-SBzl константа специфичности kcat/Km L-HEP совпадает с kcat/Km рекомбинантной легкой цепи энтеропептидазы быка (L-BEP), а при расщеплении субстратов по специфическому сайту превышает ее на порядок. Эти результаты, с одной стороны, предполагают сходство ферментов в субстрат-связывающем центре S1 и конформации остатков, непосредственно участвующих в гидролизе субстрата, с другой – их отличие в субстрат-связывающих центрах S2-Sn.

Повышение содержания в реакционном буфере ионов Са2+ (>0.1 мМ) ингибировало расщепление субстратов со специфическим сайтом, однако совершенно не влияло на расщепление Z-Lys-SBzl (рисунок 3). Эффект ингибирования, скорее всего, связан с координированием и ионным взаимодействием ионов кальция с тетрааспартатом субстрата, не дающих последнему связываться со вторичным субстрат-связывающим центром фермента. Хотя изучение первичной последовательности L-HEP не обнаружило в ней специализированных кальций-связывающих центров (в некоторых протеиназах семейства химотрипсина Са2+-связывающий регуляторный сайт образуют отрицательно заряженные остатки в положениях 70 и 80 полипептидной цепи), наблюдалась небольшая стимуляция активности микромолярными концентрациями ионов кальция (рисунок 3а).

Это может быть обусловлено незначительной стабилизацией структуры L-HEP при связывании ионов кальция кислыми остатками на поверхности молекулы.

Повышенные концентрации солей щелочных металлов (в частности, NaCl) ингибировали гидролиз специфических субстратов. Это, видимо, обусловлено экранированием заряженных остатков в окрестности активного центра и ослаблением электростатических взаимодействий пептида DDDDK с S2-S5 остатками фермента (в частности, с петлей 96-99).

Рисунок 3. Влияние ионов Ca2+ на скорость гидролиза GD4K-na и гибридного белка Trx/hEGF с помощью L-HEP:

а – гидролиз GD4K-na в присутствии различных концентраций CaCl2 или 1 мМ ЭДТА (точка 0 на абсциссе диаграммы);

б - пробы, содержащие 15 мкг Trx/hEGF, инкубировали при 25 °C с 0.001 ед. акт. L-HEP (по расщеплению Z-Lys-SBzl) в буфере, содержащем 0.1 М Tris-HCl (pH 8.0), в течение ч.

Было исследовано влияние различных ингибиторов на каталитическую активность L-HEP (таблица 2). Наибольшее влияние на фермент оказали конкурентные ингибиторы трипсин-подобных сериновых протеиназ (СИТ, бычий панкреатический ингибитор трипсина (апротинин), бензамидин) ингибитор химотрипсина леупептин и ингибитор цистеиновых протеиназ Е-64. На активность практически не влияли многие ингибиторы химотрипсина и мателлопротеиназ. В связи с высокой гомологией СИТ и природных ингибиторов трипсинов млекопитающих, было подробно изучено ингибирование гидролиза Z-Lys-SBzl L-HEP при связывании СИТ. Кинетические данные аппроксимировали методом нелинейной регрессии с помощью программы Origin 7.(Microcal, США) к уравнению 2, [P] = v0t + (V0 – Vs)(1 – exp(-kobst))/kobs [Уравнение 2], где [P] – концентрация 3-карбокси-4-нитрофеноксида во время t, Vs – скорость реакции в стационарном состоянии, V0 – начальная скорость реакции и kobs – константа видимой скорости перехода от V0 к Vs. Линейная зависимость kobs от концентрации СИТ (рисунок 4) показывает, что медленное ингибирование L-HEP соответствует следующему механизму связывания СИТ:

медленно kE + I V EI kИнгибирование по этому механизму не включает в себя медленную изомеризацию фермента либо комплекса фермент-ингибитор. Кинетические параметры ингибирования:

k1 = 0.033 нM-1 мин-1, k2 = 0.076 мин-1 и Ki* = k2/k1 = 2.3 нМ были определены из графика зависимости kobs от концентрации СИТ [I] (уравнение 3):

kobs = k2 + k1[I]/(1 + [S]/Km) [Уравнение 3], где [S] – это концентрация субстрата Z-Lys-SBzl, для которого Km – константа Михаэлиса.

Такой же механизм ингибирования с помощью СИТ с Ki* = 1.6 нМ наблюдался для L-BEP.

Рисунок 4. Ингибирование L-HEP СИТ. А - Реакцию гидролиза Z-Lys-SBzl в присутствии 0, 1.5, 3, 6, 10, 20, 33, 50 нМ СИТ (сверху вниз) начинали добавлением 0.34 нМ L-HEP, и кривые непрерывно регистрировались в течение 30 мин. В каждом случае за исключением концентрации 1.5 нМ расход субстрата не превышал 10%. Б - График зависимости kobs от концентрации СИТ.

-OD obs k (мин ) Таблица 2. Влияние ингибиторов Таблица 3. Влияние различных протеиназ на гидролитическую денатурирующих агентов на скорость активность L-HEP. Значения активностей расщепления Z-Lys-SBzl с помощью Lпредставлены как средние ± HEP. В графе «Активность» представлено среднеквадратичное отклонение, исходя из отношение скорости гидролиза в присутствии трех независимых измерений. денатуранта к скорости в начальной реакции как среднее ± среднеквадратичное Активность, отклонение, исходя из трех независимых Ингибитор Концентрация % измерений.

СИТ 3 нМ 46.1 ± 1.Денатурирую Активность, Концентрация -щий агент % 33 нМ 6.0 ± 0.Triton X- 0.1% 70 ± Апротинин 250 нМ 36.0 ± 1.1.0% 18 ± 2 мкМ 8.8 ± 0.Tween 0.1% 80 ± Леупептин 10 мкМ 6.3 ± 0.3 1.0% 25 ± ДСН 0.1% 60 ± Антипаин 10 мкМ 15.7 ± 1. 1.0% 28 ± 100 мкМ 4.5 ± 0.Этанол 1.0% 90 ± E-64 10 мкМ 52.4 ± 1.10.0% 70 ± 100 мкМ 16.3 ± 0.Имидазол 50 мM 97 ± Бензамидин 100 мкМ 35.6 ± 0.250 мM 68 ± ДТТ 1 мМ 8.2 ± 0.5 5.0 мM 100 ± 20.0 мM 91 ± Химостатин 100 мкМ 81.1 ± 2.NaCl 0.1 M 150 ± Пепстатин A 100 мкМ 95.0 ± 1.1.0 M 225 ± Бестатин 100 мкМ 93.0 ± 1.KCl 0.1 M 120 ± ФМСФ 1 мМ 45.9 ± 1.1.0 M 100 ± ТЛХК 1 мМ 87.0 ± 1.5 Мочевина 1.0 M 50 ± 6.0 M 10 ± ЭДТА 10 мМ 100.0 ± 3.При расщеплении Z-Lys-SBzl L-HEP показала высокую толерантность по отношению к присутствию в реакционном буфере различных детергентов, солей и других реагентов (таблица 3). Влияние рН реакционного буфера на гидролиз малых субстратов было различным: в случае Z-Lys-SBzl наблюдалась колоколообразная кривая зависимости скорости гидролиза от рН с максимумом при рН 7.54. Гидролиз GD4K-na ускорялся при изменении рН от 6 до 9. Подобная картина наблюдалась при гидролизе пептидов другими ферментами, в частности наттокиназой, и может быть объяснена использованием ферментом гидроксил-иона вместо воды в ферментативной реакции.

Построение пространственной модели L-HEP.

Пространственная модель легкой цепи энтеропептидазы человека была построена (рисунок 5) на основе кристаллической структуры легкой цепи энтеропептидазы быка в комплексе с ингибитором VD4K-хлорметаном (1EKB в базе данных белковых структур PDB), чья аминокислотная последовательность идентична человеческому аналогу для 83% и гомологична для 93% остатков. Для построения пространственной модели использовали программный пакет Insight II (Accelrys, США). Из структуры была удалена молекула ингибитора и пептид, соответствующий части тяжелой цепи энтеропептидазы, связанный Рисунок 5. Пространственная модель L-HEP. 3-мерная структура легкой цепи энтеропептидазы человека была построена по гомологии ферментов человека и быка, на основе кристаллической структуры 1EKB с помощью программного пакета INSIGHT II. Синим цветом обозначены Р1-Ростатки субстрата. Отображены боковые цепи остатков каталитической триады и цистеинов L-HEP.

Номерами аминокислотной последовательности (по химотрипсиновой нумерации) обозначены цистеины, для которых было проведено моделирование замещений другими остатками.

с легкой цепью дисульфидной связью. Выравнивание аминокислотных последовательностей легких цепей энтеропептидаз человека и быка и последующее построение пространственной модели L-HEP проводили с помощью модуля Homology.

Минимизация конформационной энергии полученной модели белка проводилась в модуле Discover методом сопряженных градиентов.

Моделирование и получение мутантных вариантов L-HEP с увеличенным выходом ренатурации.

В связи с тем, что выход ренатурации L-HEP был очень низким (2%), был произведен поиск структурных изменений, приводящих к увеличению выхода ренатурации без потери высокой активности фермента. Одной из главных проблем ренатурации многих белков является образование правильных дисульфидных связей.

Большое количество остатков цистеина в L-HEP (9, из которых 8 образуют 4 дисульфида и один остается неспаренным) значительно затрудняет ее ренатурацию из-за высокой вероятности образования неправильных дисульфидных связей. На основе сравнения аминокислотных последовательностей энтеропептидазы и родственных ей сериновых протеиназ было предположено, что цистеины 122 (неспаренный), 136 и 201 (образующие дисульфидную связь) не обязательны для поддержания каталитической активности фермента. Было проведено выравнивание полученной модели с кристаллической структурой матриптазы (1ЕАХ) – наиболее близкого к энтеропептидазе фермента с отсутствующей дисульфидной связью Cys136-Cys201, – с помощью которого был выбран определенный набор вариантов замен цистеинов 122, 136 и 201, а также близлежащих остатков (с целью стабилизировать этот участок молекулы в отсутствие дисульфидной связи Cys136-Cys201). Анализ показал, что структурно близкие L-HEP сериновые протеиназы (матриптаза, тканевый активатор плазминогена (tPA)) в положении содержат остаток с крупной боковой цепью (Trp в случае матриптазы и Arg в случае tPA), который, вероятно, стабилизирует эту область фермента в отсутствие дисульфидной связи Cys136-Cys201.

Для полученного набора аминокислотных замен были построены модели соответствующих мутантных вариантов L-HEP тем же способом, что и модель L-HEP.

Полученные 3-мерные модели мутантных вариантов L-HEP оценивались по методу Айзенберга, в котором анализируется соответствие типов аминокислотных остатков их положению в структуре белка по полярности окружения и предпочтению ими определенного типа вторичной структуры. Кроме того, оценивалась энергия взаимодействия замененного аминокислотного остатка с окружением и заполненность внутреннего пространства молекулы белка.

Варианты L-HEP с заменами C122S, C136V/S137R/C201D (VRD), C136V/S137R/C201M (VRM), C136A/S137R/C201D (ARD), C136V/C201D (VD) (с наиболее оптимальными по критерию Айзенберга заменами остатков) были подвергнуты дальнейшему тестированию с помощью молекулярной динамики (МД). Для расчетов МД белков использовался программный пакет GROMACS (версия 3.2). Использовалось силовое поле GROMOS87, оптимальное для расчетов МД белков в окружении явно заданных молекул воды (молекулярная модель воды SPC). Для моделей L-HEP и ее мутантных вариантов были рассчитаны траектории МД длительностью 15 нс. Для всех траекторий были рассчитаны среднеквадратичное отклонение по позициям атомов белка относительно стартовой структуры (СКО) и их среднеквадратичные флуктуации относительно усредненной в МД структуры (СКФ). Анализ вторичной структуры белков в МД проводился с помощью программы DSSP. МД показала одинаковую стабильность как отдельных участков, так и целых молекул L-HEP/С122S и L-HEP, в случае же остальных мутантных вариантов наблюдались большие, чем у L-HEP, отклонения от исходной структуры. В целом все мутантные варианты были достаточно стабильны (СКО0.2 нм для атомов основной цепи), а их вторичная структура не претерпевала заметных изменений. Варианты с заменами C122S, VRD, и ARD были взяты для экспериментальной проверки.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»