WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 ||

Согласно результатам, полученным в главе 3, для определения норвалина и норлейцина можно было использовать колонку MAX-RP и буферный раствор ацетата аммония с pH 6.4 или колонку Hydro-RP и буферный раствор pH с 5.8, применяя флуоресцентное детектирование. Однако, исследования показали, что в процессе анализа реальных образцов на колонке MAX-RP неизвестный компонент № 31 (рис. 6а) не разделяется с норвалином, что подтверждают спектры флуоресценции. Поэтому целесообразно применение колонки HydroRP для анализа данных образцов (рис. 6б).

Масс-спектры, полученные в максимумах хроматографических пиков ХАКпроизводных, подтвердили накопление аминокислот норвалина и норлейцина в КЖ исследуемого штамма E. coli. Полученные результаты вошли в патентную заявку РФ № 2004127011.

Идентификация примеси гомоизолейцина. Известно, что бактериальные штаммы E.coli, продуцирующие лейцин, способны накапливать примеси гомолейцина. При исследовании КЖ этих штаммов показано, что наряду с гомолейцином может также образовываться и другая непротеиногенная аминокислота – гомоизолейцин. Для анализа накопления изомеров гомоизолейцина и гомолейцина, наряду с колонкой Hydro-RP, была использована колонка LUNA C18(2) 150 x 2 мм (рис. 7).

Идентификация 4-гидроксиизолейцина. 4-гидроксиизолейцин – непротеиногенная аминокислота, обладающая инсулинотропным и противодиабетическим действием. Получение 4-гидроксиизолейцина in vitro возможно посредством сопряжения ферментативных активностей альдолазы и аминотрансферазы из ацетальдегида, -кетобутирата и глутамата. На рисунке приведены хроматограммы ХАК-производных изомеров 4гидроксиизолейцина, образовавшихся в результате сопряженных ферментативных реакций. Для разделения использована колонка LUNA C18(2) 150 x 2 мм. Полученные результаты вошли в патентную заявку РФ № 2005127811.

С помощью предложенного метода ВЭЖХ/МС в КЖ различных штаммов также были идентифицированы: о-, м-, п-изомеры гидроксифенилаланина и димер валина.

Рис. 8. Хроматограммы реакционных смесей сопряженных ферментативных реакций.

а-б) Хроматограммы, полученные с помощью флуориметра. а’-б’) Масс-хроматограммы продуктов по соответствующим протонированным молекулярным ионам ХАК-производных m/z = 318. а-а’) модельная смесь, б-б’) образец реакционной смеси сопряженных реакций.

Условия разделения: t 25oC, градиент № 4. 1 – глутамат, 2 – N-(6-хинолинил)-мочевина, 3 – 6-аминохинолин, 4 – 2-аминомасляная кислота, 5 - 7 – изомеры 4-гидроксиизолейцина.

Идентификация примеси путресцина. Известно, что в клетках микроорганизмов биогенные полиамины (агматин, путресцин, спермидин) образуются в результате декарбоксилирования основных аминокислот.

Присутствие этих соединений в КЖ свидетельствует об активации путей деградации соответствующих аминосоединений. При исследовании КЖ штаммов E.coli, продуцирующих аргинин, показано, что наряду с его предшественником – орнитином, происходит накопление путресцина (рис. 9).

Для разделения использована колонка Synergi Hydro-RP 250 х 4.6 мм (обоснование выбора условий дано в главе 3).

Применение КЭ для анализа дикарбоновых и N-замещенных аминокислот, как продуктов ферментативных реакций в реакционных смесях.

Анализ глутаминовой кислоты. В процессе изучения путресцинтрансаминазы, участвующей в процессе деградации путресцина и биосинтеза ГАМК в клетках E.coli, необходима оценка активности этого фермента в разных штаммах. Как следует из схемы реакции (путресцин + 2оксоглутарат = 4-аминобутаналь + глутамат) измерение ферментативной активности можно проводить по накоплению глутаминовой кислоты.

Рис. 10. Электрофореграммы реакционных смесей после инкубирования ферментного препарата для измерения активности путресцинтрансаминазы: а) 0 мин; б) 3 ч. Напряжение – 20 кВ, термостатирование +200С, ввод образца 5 сек. 1 – аспартат (добавлен в качестве внутреннего стандарта), 2 – глутамат.

Как видно из электрофореграмм, представленных на рисунке 10, в реакционной смеси в процессе инкубирования фермента наблюдается накопление глутамата.

Анализ аргининоянтарной кислоты. При работе со штаммом E.coli, продуцирующим аргинин, одним из этапов оптимизации направления работы являлась оценка активности аргининосукцинат-синтетазы. Активность этого фермента (цитруллин + аспартат + АТФ = АМФ + ФФн + аргининосукцинат) оценивали по количеству образовавшейся аргининоянтарной кислоты. Как показано на рисунке 11 (а, б), накопление аргининосукцината происходит в результате инкубирования ферментного препарата штамма E.coli B-2525/pUCargG, содержащего плазмиду с клонированным геном argG.

Рис. 11. Электрофореграммы реакционных смесей после инкубирования бесклеточных экстрактов штамма E. coli B-2525/pUC-argG для измерения активности аргининосукцинатсинтетазы: а) 0 мин; б) 15 мин. Напряжение –25 кВ, термостатирование +200С, ввод образца 20 сек. 1 – AТФ, 2 – АМФ, 3 – аспаратат, 4 – аргининосукцинат.

Также, с помощью разработанного метода КЭ в реакционных смесях различных ферментативных реакций провели определение N-ацетилглутамата и фосфорилированных продуктов: карбамоилфосфата и О-фосфогомосерина.

Выводы.

1. Показано, что ХАК-производные аминокислот подчиняются общим закономерностям удерживания соединений на обращенной фазе, что подтверждается изменением удерживания внутри гомологических рядов, структурных изомеров, а также при введении в молекулу полярных функциональных групп.

2. Исследовано влияние pH и концентрации буферного раствора на удерживание ХАК-производных аминокислот и полиаминов при разделении в условиях ОФ-ВЭЖХ. Показано, что в диапазоне pH 3.5 – характер полученных зависимостей связан с образованием цвиттерионной или нейтральной формы разделяемых ХАК-производных в исследованной области pH, что определяется природой заместителя изучаемых аминокислот.

3. Установлено, что для масс-спектров ХАК-производных основных аминокислот и полиаминов характерно образование двузарядных ионов наряду с протонированным молекулярным ионом. Показано, что варьируя параметры источника ионизации (напряжение на конусе и экстракторе) можно изменять относительные интенсивности и соотношения сигналов протонированных молекулярных, двузарядных и фрагментных ионов, наблюдаемых в масс-спектрах ХАК-производных аминокислот и полиаминов.

4. С помощью метода КЭ получены зависимости времени миграции анионов дикарбоновых и N-замещенных аминокислот от концентрации компонентов разделяющего буфера. На основании полученных закономерностей предложены условия анализа продуктов реакционных смесей при исследовании активностей ферментов, участвующих в биосинтезе аминокислот. Результаты включены в патент РФ № 2264459.

5. С помощью метода ВЭЖХ/МС идентифицированы аминокислоты, в том числе и непротеиногенные (ГАМК, п-, м-, о- изомеры гидроксифенилаланина, гомоизолейцин, норвалин, норлейцин, орнитин), димер валина и биогенный амин путресцин, накапливаемые в культуральных жидкостях штаммов-продуцентов. Подтверждена возможность получения 4гидроксиизолейцина с помощью ферментативного синтеза. Полученные результаты вошли в патент РФ № 2241036 и патентные заявки РФ № 2004127011, № 2005127811.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. Новикова А.Е., Ямпольская Т.А., Гусятинер М.М. Использование капиллярного электрофореза для определения N-ацетилглутамата, аргининсукцината и карбамилфосфата при измерении активности ферментов пути биосинтеза аргинина // Биотехнология. 2004. № 3. С. 78-86.

2. Новикова А.Е., Анисимова О.С., Турчин К.Ф., Фомина С.А., Лунц М.Г., Дегтерев Е.В. Идентификация и анализ -аминомасляной кислоты в культуральных жидкостях штаммов-продуцентов // Химико-фармацевтический журнал. 2005. Т.39. № 4. С. 47-52.

3. Samsonova N.N., Smirnov S.V., Novikova A.E., Ptitsyn L.R. Identification of Escherichia coli K12 YdcW protein as a -aminobutyraldehyde dehydrogenase // FEBS Letters. 2005. V. 579. P. 4107-4112.

4. Новикова А.Е., Стоинова Н.В., Сычева Е.В., Колоколова А.В.

Идентификация и анализ непротеиногенных аминокислот норвалина и норлейцина в культуральных жидкостях штаммов Escherichia coli // Сорбционные и хроматографические процессы. 2006. Т. 6. № 5. С. 796-806.

5. Новикова А.Е., Колоколова А.В., Буряк А.К. Идентификация полиаминов методом ВЭЖХ/МС в культуральных жидкостях штаммов Escherichia coli // Сорбционные и хроматографические процессы. 2007. Т. 7. № 1. С. 66-77.

6. Новикова А.Е., Стоинова Н.В., Ямпольская Т.А., Буряк А.К. Идентификация аминокислот, в том числе их структурных изомеров, в виде N-[(6хинолиниламино)карбонил]-производных методом ВЭЖХ-МС // Сорбционные и хроматографические процессы. 2007. Т. 7. № 3. С. 430-443.

7. Smirnov S. V., Samsonova N.N., Novikova A.E., Matrosov N.G., Rushkevich N.Y., Kodera T., Ogawa J., Yamanaka H., Shimizu S. A novel strategy for enzymatic synthesis of 4-hydroxyisoleucine: identification of an enzyme possessing HMKP (4hydroxy-3-methyl-2-keto-pentanoate) aldolase activity // FEMS Microbiology Letters. 2007. V. 273. P. 70-77.

8. Фомина С.А., Новикова А.Е., Лунц М.Г., Гусятинер М.М. Способ получения гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) // Патент РФ № 2241036. Опубликован 27.11.2004. Бюл. № 33.

9. Птицын Л.Р., Смирнов С.В., Альтман И.Б., Новикова А.Е., Котлярова В.А., Гусятинер М.М., Ростова Ю.Г., Ямпольская Т.А. Новая мутантная карбамоилфосфатсинтетаза и способ продукции соединений – производных карбамоилфосфата // Патент РФ № 2264459. Опубликован 20.11.2005.

Бюл. № 32.

10. Стоинова Н.В., Сычева Е.В., Преображенская Е.С., Новикова А.Е., Матросов Н.Г. Способ получения непротеиногенных аминокислот с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, в которой все синтазы ацетогидроксикислот инактивированы // Патентная заявка РФ № 2004127011.

Опубликована 20.02.2006. Бюл. № 5.

11. Смирнов С.В., Самсонова Н.Н., Новикова А.Е., Матросов Н.Г., Рушкевич Н.Ю., Птицын Л.Р., Мацуи К., Кодера Т. Способ ферментативного получения 4гидроксиизолейцина // Патентная заявка РФ № 2005127811. Опубликована 20.03.2007. Бюл. № 8.

12. Новикова А.Е., Фомина С.А., Анисимова О.С., Турчин К.Ф., Лунц М.Г., Дегтерев Е.В. Идентификация и анализ -аминомасляной кислоты в культуральных жидкостях штаммов-продуцентов // Тезисы докладов XII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». Москва. 18 – апреля, 2005. С. 778.

13. Новикова А.Е., Ямпольская Т.А., Стоинова Н.В., Серебряный В.А., Матросов Н.Г., Сычева Е.В. Идентификация и анализ непротеиногенных аминокислот с помощью метода обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии // Тезисы докладов X международной конференции «Теоретические проблемы химии поверхности, адсорбции и хроматографии».

Москва – Клязьма. 24 – 28 апреля, 2006. С. 305.

14. Новикова А.Е., Буряк А.К. Идентификация и анализ полиаминов методом ВЭЖХ и ВЭЖХ/МС в культуральных жидкостях штаммов Escherichia coli // Тезисы докладов III международной конференции-школы «Массспектрометрия в химической физике, биофизике и экологии». Звенигород. 16 – 21 апреля, 2007. С. 145.

15. Новикова А.Е., Буряк А.К. Жидкостная хроматография с флуоресцентным и масс-спектрометрическим детектированием при анализе биогенных аминов и изомерных аминокислот // Тезисы докладов Всероссийского симпозиума «Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях».

Москва – Клязьма. 23 – 27 апреля, 2007. С. 45.

16. Новикова А.Е., Киверо А.Д., Буряк А.К. Использование метода капиллярного электрофореза в режиме непрямого детектирования для измерения активностей ферментативных реакций // Тезисы докладов научноприкладного семинара «Аналитические методы и приборы для химического анализа». Санкт-Петербург. 29 – 31 августа, 2007. С. 24.

17. Новикова А.Е., Смирнов С.В., Буряк А.К. Сравнение методов ВЭЖХ с флуориметрическим и масс-спектрометрическим детектированием при идентификации и анализе аминированных метаболитов в виде N-[(6хинолиниламино)карбонил]-производных // Тезисы докладов II Всероссийской конференции с международным участием «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы». Москва. 3 – 7 сентября, 2007. С. АС-8.

18. Колоколова А.В., Стоинова Н.В., Новикова А.Е. Определение дивалина, секретируемого валинустойчивыми клетками E. coli, с применением ВЭЖХ // Тезисы докладов XVIII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии.

Москва. 23 – 28 сентября, 2007. В пяти томах. Т.4. С. 163.

Pages:     | 1 | 2 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»