WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

В работе использована установка капиллярного электрофореза Quanta (Waters, США) снабженная ультрафиолетовым детектором с фиксированной длинной волны 254 нм и программным обеспечением для обработки хроматографических данных Мультихром 2.0 для Windows (Амперсенд, Россия). Разделение проводили в кварцевом капилляре с внутренним диаметром 75 мкм (Waters, США). Общая длина капилляра – 60 см, эффективная длина (до детектора) – 53 см. Использовали воздушное термостатирование капилляра и гидростатический ввод образцов.

Кислотность водных растворов контролировали с помощью рН-метра МР 225 (Mettler Toledo, Швейцария). В работе использовали центрифугу 5415D (Eppendorf, Германия) и ультразвуковую баню 2510E-DTH (Bransonic, США).

Для получения производных аминокислот и полиаминов реагент 1-[[(6хинолиниламино)карбонил]окси]-2,5-пирролидиндион готовили по стандартной методике растворением точной навески в ацетонитириле (3 мг/мл).

ХАК-производные (рис. 1) готовили непосредственно перед проведением эксперимента по следующей методике: аликвоту модельной смеси или образца смешивали с раствором боратного буфера с рН 8.0 и добавляли раствор реагента (1 : 5 : 4). Реакцию проводили при температуре 55оС в течение 10 мин.

В качестве стандартных соединений были взяты аминокислоты (Sigma, США), биогенные полиамины (Aldrich, США). Растворы аминокислот и полиаминов готовили растворением соответствующего реактива в деионизованной воде и хранили при температуре –20оС. Растворы элюентов готовили непосредственно перед экспериментом.

Рис. 1. Реакции, сопровождающие получение флуоресцирующих производных аминокислот по методу Accq-Tag: a) реакция образования производных первичных и вторичных аминов и аминокислот, б) реакция гидролиза избытка 1-[[(6-хинолиниламино)карбонил]окси]-2,5пирролидиндиона.

3 глава. Результаты и обсуждение.

Исследование влияния условий хроматографического разделения на удерживание ХАК-производных.

Известно, что разделение аминокислот и биогенных аминов, как правило, осуществляют с использованием процедуры получения производных, характеризующихся большим удерживанием на обращенной фазе и содержащих группы, флуоресцирующие или поглощающие в ультрафиолетовой области спектра. Поэтому для работы нами был выбран метод, основанный на получении устойчивых ХАК-производных аминов и аминокислот с последующим разделением в режиме ОФ-ВЭЖХ. Для работы в качестве сорбентов были выбраны: Synergi Hydro-RP, MAX-RP, LUNA C18(2), AQUA C18, Zorbax Eclipse XDB-C18. В качестве подвижной фазы использовали элюенты, содержащие совместимые с МС компоненты: ацетонитрил и ацетат аммония.

В результате исследования влияния органического модификатора на удерживание аналитов с использованием уравнения Скотта – Кучеры показано, что для ХАК-производных аминокислот характерно образование ассоциатов с ацетонитрилом. Из рассчитанных значений logP с помощью некоммерческой версии программы AСD/labs получено, что ХАК-производные аминокислот – вещества с резко различающейся полярностью. Поэтому, для работы с этими соединениями целесообразно использовать градиентное элюирование.

В результате сравнения колонок Synergi Hydro-RP, MAX-RP, LUNA C18(2) и AQUA C18 получено, что в условиях нейтрального рН усиление удерживания ХАК-производных основных соединений наблюдается на сорбентах AQUA Cи MAX-RP. При сопоставлении в изократических условиях разрешающей способности исследуемых колонок согласно полученным расчетным данным основных хроматографических параметров (фактор удерживания, число теоретических тарелок, разрешение пиков) показано, что наибольшей эффективностью обладает колонка LUNA C18(2), которая была в дальнейшем использована для разделения ХАК-производных диастереомеров.

При исследовании зависимости удерживания ХАК-производных аминокислот и полиаминов от pH применяли градиентное элюирование. В результате проведенных исследований отмечены следующие закономерности:

- с увеличением pH с 3.5 до 7, увеличивалось время удерживания ХАКпроизводных аминокислот, содержащих основные функциональные группы, что, предположительно, связано с переходом производных этих соединений из катионной в цвиттер-ионную форму, а для лизина и орнитина – из катионной в анионную форму через цвиттер-ион;

- аналогичная зависимость наблюдалась для 6-аминохинолина, N-(6хинолинил)-мочевины, а также для производных спермидина и путресцина, что, в свою очередь, связано с переходом этих соединений из катионной формы в нейтральную;

- для ХАК-производных дикарбоновых аминокислот и большей части аминокислот с неполярными заместителями наблюдалась обратная зависимость в том же диапазоне pH, что, вероятно, связано с переходом производных этих соединений из цвиттер-ионной формы в анионную;

- зависимость удерживания производного ГАМК от pH раствора имеет резко выраженный максимум. Предположительно, это связано с узкой зоной pH, при которой ГАМК существует в виде цвиттер-иона, что отличает эту аминокислоту от других исследованных соединений.

Для разделения ХАК-производных аминокислот и полиаминов предложено использовать буферный раствор с рH 6.8.

При исследовании влияния концентрации ацетата аммония в диапазоне 1 – 10 мМ (рН 6.8) показано, что для тех ХАК-производных аминокислот, которые находятся в виде ионов, удерживание увеличивается с увеличением концентрации соли, что объясняется эффектом «высаливания». В тоже время изменение концентрации буферного раствора не влияет на соединения в нейтральной форме, такие как 6-аминохинолин, N-(6-хинолинил)-мочевина, производные спермидина и путресцина. Иным образом ведет себя агматин. Для производного этого соединения наблюдается эффект «всаливания», что проявляется в уменьшении удерживания.

В результате проведенных исследований было также установлено, что ХАКпроизводные аминокислот подчиняются общим закономерностям удерживания в условиях ОФ-ВЭЖХ:

- время удерживания возрастает внутри гомологических рядов ХАКпроизводных с ростом числа атомов углерода в молекуле. Для высших членов гомологического ряда значения относительного изменения свободной энергии аддитивны по группам -CH2-, при этом вклад одной метильной группы составляет 2.3 кДж/моль;

- для структурных изомеров при переходе от разветвленной к линейной конфигурации углеродной цепи удерживание увеличивается;

- при введении в молекулу полярных функциональных групп (-OH, -NH2), которые сильнее взаимодействуют с полярным элюентом, удерживание уменьшается;

- полученные в изократических условиях (18 % ацетонитрил – водный раствор ацетата аммония 10 мМ рН 6.8) на колонке Synergi Hydro-RP корреляции фактора удерживания ХАК-производных аминокислот с числом атомов углерода в молекуле и logP могут быть использованы для прогнозирования удерживания ХАК-производных других соединений со структурой, близкой к исследованному ряду веществ.

Исследование влияния параметров источника масс-спектрометра на ионизацию ХАК-производных.

В процессе работы с ХАК-производными аминокислот исследовано влияние параметров источника ионизации на масс-спектры анализируемых соединений.

Для большинства ХАК-производных аминокислот основным сигналом в массспектре является молекулярный протонированный ион. Также наблюдается небольшой сигнал фрагментного иона c m/z = 171. Показано, что при уменьшении напряжения на конусе источника с 40 до 20 В и при уменьшении напряжения на экстракторе с 4 до 2 В увеличивается соотношение MH/(рис. 2). Изменение напряжения на капилляре в диапазоне 2 – 3 кВ и температуры 300 – 4500С несущественно влияло на соотношение MH/171. В связи с этим, для дальнейшей работы были выбраны следующие параметры источника: напряжение на конусе 20 В, напряжение на экстракторе 2 В, напряжение на капилляре 2 кВ, температура распыления 4500С.

Показано, что при ионизации в условиях положительного электроспрея и 20 В на конусе источника ионизации ХАК-производных основных аминокислот и полиаминов, кроме протонированного молекулярного иона образуются также двузарядные ионы. Как показано на рисунке 3, агматин дает двузарядный ион (m/z = 151), что может происходить вследствие протонирования гуанидиновой группы.

a) MH/171 б) MH/I, отн I, отн 7 6 15 25 35 9 1,5 2,5 3,5 4,конус, В Экстрактор, В Рис. 2. Зависимость соотношения интенсивностей [МН]+/171 ХАК-производных аминокислот от параметров источника ионизации: а) напряжение на конусе, б) напряжение на экстракторе. 3 – серин, 4 – глицин, 5 – треонин, 7 – аланин, 9 – аргинин, 13 – метионин, 15 – лейцин.

Аналогичный эффект наблюдается и в спектре аргинина (m/z = 173), при этом двузарядный ион не возникает в спектрах N-ацетил-замещенных производных орнитина. Двузарядные ионы образуются, вероятно, вследствие присутствия нескольких ХАК-заместителей в молекуле и регистрируются в спектрах ХАК-производных лизина (m/z = 244), спермидина (m/z = 329), путресцина (m/z = 215), орнитина (m/z = 237). Двузарядный ион зарегистрирован и в спектре гистидина (m/z = 163). Кроме того, в масс-спектрах производных основных аминокислот и полиаминов образуются следующие фрагменты: [MH - 170]+ для лизина (m/z = 317), аргинина (m/z = 175), гистидина (m/z = 156), орнитина (m/z = 303) и агматина (m/z = 131), [MH - 186 - 170]+ для спермидина (m/z = 301). В случае лизина и орнитина – ионы m/z = 317 и m/z = 303, вероятно, соответствуют ХАК-производным по одной из аминогрупп, образованным в источнике ионизации при отщеплении фрагмента 170. Ионы с m/z = 175, m/z = 156, m/z = 116, m/z = 147, m/z = 131 соответствуют протонированным молекулярным ионам исходных аминосоединений: аргинина, гистидина, пролина, лизина и агматина соответственно. Ионы протонированных молекул исходных соединений, образующихся в источнике ионизации, также регистрируются в спектрах ХАК-производных орнитина (m/z = 133) и путресцина (m/z = 89). При увеличении напряжения от 20 до 30 В наблюдается подавление сигнала двузарядных ионов при несущественном изменении интенсивности протонированных молекулярных ионов исследуемых соединений.

[М+Н]+ орнитин N I, 100% O NH NH [М+2Н]2+ [ornH]+ NH NH HO O [МН-302]+ O N [МН-170]+ 133 [М+Na]+ m/z 200 300 400 500 600 агматин 2+ HN I, 100% 151[М+2Н] NH HN [М+Н]+ NH NH [agmH]+ O N [МН-130]+ [М+Na]+ m/z 200 300 400 500 600 аргинин [М+Н]+ I, 100% 345 HN [М+2Н]2+ O 173 N HN [МН-174]+ H2N NH O [argН]+ NH OH m/z 150 200 250 300 350 400 Рис. 3. Масс-спектры, полученные в максимуме хроматографического пика ХАКпроизводных полиаминов и аминокислот. Протонированные молекулярные ионы: [ornH]+, [agmH]+, [argH]+ - орнитина, агматина и аргинина соответственно.

При значении 40 В отмечено 10-кратное падение интенсивности двузарядных и протонированных молекулярых ионов, а также существенное увеличение интенсивности дочернего иона m/z = 171. Поскольку этот фрагмент не является селективным и характерен для всех ХАК-производных аминосоединений, сделан вывод, что дальнейшее увеличение напряжения на конусе источника нецелесообразно. Полученные данные показывают, что для анализа ХАК-производных полиаминов напряжение на конусе должно быть не более 30 В.

Исследование влияния состава буферного электролита на скорость миграции дикарбоновых и N-замещенных аминокислот.

Известно, что анализ соединений, не поглощающих в области УФ, можно осуществлять с помощью метода КЭ в режиме непрямого детектирования. При разработке методики анализа смесей дикарбоновых и N-замещенных аминокислот выбран состав разделяющего буфера. Для этого проведено исследование влияния состава буферного электролита на скорость миграции и разделение аналитов (рис. 4).

Показано, что увеличение модификатора электроосмотического потока – тетрадецилтриметиламмоний бромида (ТТАБ) уменьшает время миграции анализируемых соединений в диапазоне 0.1 – 0.6 мМ, а при более высоких концентрациях – не влияет, что может быть связано с установлением устойчивого двойного слоя ТТАБ на стенках капилляра. Увеличение концентрации бензойной кислоты приводит к увеличению времени миграции аналитов, что связано с уменьшением электроосмотического потока. Время миграции анионов возрастает с увеличением концентрации трис(гидроксиметил)метиламина (ТРИС) в диапазоне 25 – 50 мМ, сопровождающимся повышением pH 5.7 – 8.1, что также можно объяснить уменьшением электроосмотического потока.

В результате проведенных исследований для анализа дикарбоновых и Nзамещенных аминокислот выбран разделительный буфер, содержащий 25 мМ бензойной кислоты, 0.25 мМ ТТАБ, 50 мМ ТРИС (pH 8.1).

4 глава. Применение разработанных методов.

Идентификация аминокислот и полиаминов в биотехнологических образцах.

Идентификация ГАМК. При работе с продуцентом пролина на одном из этапов селекции было обнаружено, что при изменении состава ростовой среды продукция пролина резко падала, при этом происходило накопление другого аминосоединения. На первом этапе исследования это соединение было выделено из КЖ с помощью препаративной бумажной хроматографии и идентифицировано как ГАМК с помощью методов масс-спектрометрии и ЯМР.

На рисунке 5 представлена полученная методом ВЭЖХ/МС хроматограмма КЖ одного из исследуемых штаммов, подтверждающая его способность накапливать ГАМК, которая является нейромедиатором и применяется как лекарственное средство при сосудистых заболеваниях головного мозга.

Следовательно, подтверждение способности исследованного штамма к сверхсинтезу этого соединения может иметь потенциальный интерес для микробиологического и фармацевтического производств. Полученные результаты вошли в патент РФ № 2241036.

Рис. 5. Хроматограмма КЖ штамма E.coli (c добавлением 200 мг/л изолейцина в ростовую среду), зарегистрированная по полному ионному току и масс-спектр, полученный в максимуме хроматографического пика № 20. Для разделения была использована колонка Hydro-RP 250 x 4.6, 4 мкм, t 25oC, градиент № 1. 11 – NH4+ (N-(6-хинолинил)-мочевина), 17 – 6-аминохинолин, 20 – ГАМК.

Идентификация норвалина и норлейцина. Непротеиногенные аминокислоты, такие как как норвалин и норлейцин, которые используются для производства пищевых добавок, гомеопатических препаратов и других фармацевтических средств, можно получать с использованием бактериальных штаммов.

Рис. 6. Хроматограмма КЖ штамма E. coli B-7 DilvBNDilvGMDilvIH при разделении на колонках (250 x 4.6; 4 мкм): а) MAX-RP (pH 6.4) и б) Hydro-RP (pH 5.8). Условия разделения:

t 23oC, градиент № 2. 7 – NH4+ (N-(6-хинолинил)-мочевина), 20 – норвалин, 21 – норлейцин, 31 – неизвестный компонент.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»