WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 ||

yej мутанты, полученные методом направленного мутагенеза, устойчивы к МсС и к его синтетическим аналогам, но чувствительны к аналогам процессированного МсС. Методом направленного мутагенеза9 в лаборатории д. Wanner (Purdue University, США) были получены четыре штамма E. сoli, не содержащие генов yejA, yejB, yejE или yejF, и нами была определена их чувствительность к МсС. Оказалось, что все эти штаммы устойчивы к антибиотику (Рис. 7). В экстрактах клеток каждого из мутантов - yejA, yejB, yejE и yejF - так же, как в экстрактах клеток дикого типа, наблюдалось полное ингибирование реакции аминоацилирования тРНКAsp при добавлении МсС (Рис. 8), что указывает на то, что и процессинг МcС и фермент-мишень остались неизмененными. Таким образом, продукты генов оперона yejABEF действительно необходимы для обеспечения чувствительности клеток к МсС и, скорее всего, действуют на стадии проникновения антибиотика в клетку.

Нами была проверена устойчивость yej мутантов к химическим аналогам зрелого МсС и соответствующим аналогам процессированного МсС (синтетические аналоги МсС содержат остатки Asp, Leu или Glu в 7 положении гептапептида и ингибируют соответствующие аминоацил-тРНК-синтетазы; кроме того, в структуре этих соединений отсутствует аминопропильная группа (Рис. 1 д)). В качестве контроля использовались клетки дикого типа. Из рис. 9 видно, что клетки чувствительны ко всем аналогам процессированного МсС, но устойчивы к синтетическим аналогам МсС.

На основании полученных данных можно заключить, что YejABEF необходим для транспорта МсС и его аналогов, но не участвует в транспорте аналогов процессированного МсС.

Природа аминокислоты в 7-ом положении гептапептида не важна для узнавания транспортёром.

Ducey, T. F. & D. W. Dyer. 2002. Rapid identification of EZ:TN™ transposon insertion sites in the genome of Neisseria gonorrhoeae. EPICENTRE Forum 9:6–7.

Datsenko, K.A. & Wanner B. L. 2000. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-using PCR products. PNAS 97:6640-6645.

Рисунок 7. Рост клеток yejA в жидкой среде в присутствии зрелого МсС (10 мкг/мл). За скоростью роста клеток следили по увеличению оптической плотности среды при 600 нм (OD600). В качестве контроля использовали клетки дикого типа (дт). Аналогичная картина наблюдалась и для клеток yejB, yejE и yejF.

Рисунок 8. Реакция аминоацилирования в экстрактах клеток, мутантных по генам оперона YejABEF. S30 экстракты клеток инкубировали с интактным МсС в течение 1 часа (времени, достаточного для процессинга) при 37 °С, после чего в эту смесь добавляли компоненты для реакции аминоацилирования, включая радиоактивную аминокислоту Asp. Количество образовавшейся аминоацилированной тРНКAsp измеряли по включению радиоактивной метки во фракцию осадка, нерастворимого в холодной ТХУ.

а) [X]-AspSA [X]-LeuSA [X]-GluSA McC AspSA LeuSA GluSA 1 10 100 [X] = MRTGNA Концентрация (µM) б) McC [X]-AspSA [X]-LeuSA [X]-GluSA AspSA LeuSA GluSA 1 10 100 [X] = MRTGNA Концентрация (µM) Рисунок 9. Проверка устойчивости клеток дикого типа (а) и yejA (б) к аналогам зрелого МсС и аналогам процессированного МсС. На газон клеток были нанесены растворы тестируемых соединений и после инкубации в течение нескольких часов измерены диаметры ингибирования зон роста. Аналогичная картина наблюдалась и для культур клеток yejB, yejE и yejF.

Предсказание функций продуктов генов оперона yejABEF методами биоинформатики. Для получения дополнительной информации об опероне yejABEF был проведён биоинформатический анализ аминокислотных последовательностей YejA и YejB. Поскольку периплазматические белки известных олигопептидных транспортёров суперсемейства ABC схожи с периплазматическими белками ABC-транспортёров ионов никеля, было построено общее филогенетическое дерево периплазматических белков семейства АВС-транспортёров, отвечающих за транспорт олигопептидов и ионов никеля (включая Yej). Анализ филогенетического дерева показал, что YejA и его гомологи лежат на отдельной ветке.

Зона ингибирования ( мм ) Зона ингибирования ( мм ) Анализ филогенетических деревьев, построенных на основании аминокислотных последовательностей гомологов YejA и YejB позволил выявить белки, имеющие с ними общее эволюционное происхождение. В исследованных геномах гомологи YejA, как правило, соседствуют с гомологами YejB, и предположительно входят в состав одного оперона. Структура содержащего эти гены локуса в целом консервативна в пределах типа Proteobacteria и включает, помимо гомологов генов yejA и yejB, гомологи генов yejE и yejF.

Предполагалось, что бактерии, которые содержат оперон yej в геноме, должны быть чувствительны к действию МсС. Однако, несмотря на то, что Pseudomonas aeruginosa PAOимеет два оперона, кодирующих транспортные системы, родственные комплексу Yej, этот организм оказался устойчивым к микроцину (Н. Курепина, личное сообщение). Мы предполагаем, что поскольку AspRS – высоко консервативный фермент у бактерий и система клеточных пептидаз, в целом, консервативна, то устойчивость должна быть связана со свойствами транспортной системы. Поэтому устойчивость к МсС Pseudomonas может быть объяснена как изменениями специфичности транспортёра к МсС, так и низким уровнем экспрессии оперонов yej в данном штамме. Также возможно, что на транспорт МсС влияют другие, в настоящее время неизвестные рецепторные системы внешней мембраны.

Таким образом, в результате исследования были обнаружены и идентифицированы мутации, приводящие к устойчивости к МсС. Картирование мутаций методом однопраймерной ПЦР показало, что у отобранных нами мутантов устойчивость к МсС определяется повреждением генов АВС транспортёра, расположенного во внутренней (цитоплазматической) мембране бактериальной клетки. Гены, кодирующие четыре субъединицы транспортёра,– периплазматический белок (YejA), два трансмембранных белка (YejB и YejE) и белок, обладающий АТФ-ной активностью, (YejF) (на основании данных биоинформатического анализа) - находятся в опероне yejABEF. Опыты по проверке устойчивости к МсС клеток, лишённых отдельных генов оперона yejABEF, показали, что каждый из белков транспортёра необходим для транспорта МсС.

Механизм транспорта и структура комплекса YejABEF неизвестны. Однако есть ряд экспериментальных данных, указывающих на его функцию в клетке. Так, для патогенных штаммов Salmonella enterica показано, что мутации в yej понижают их вирулентность и повышают чувствительность к антимикробным пептидам10. Предполагают, что Yej участвует в транспорте иммуногенных бактериальных пептидов, тем самым, снижая вероятность их взаимодействия с комплексом MHC I, а также транспортирует антимикробные пептиды для их деградации в цитоплазме клетки.

Eswarappa, S. M., Panguluri K. K., Hensel M., Chakravortty D. 2008. The yejABEF operon of Salmonella confers resistance to antimicrobial peptides and contributes to its virulence. Microbiology 154: 666-678.

На основе вышеуказанных данных и данных биоинформатического анализа можно предположить, что основная функция этого транспортера связана с транспортом олигопептидов.

Но вопрос о специфичности транспортера требует дополнительных исследований.

ВЫВОДЫ 1. Продукты генов mccD и mccE микроцинового оперона mccABCDE отвечают за присоединение аминопропильной группы к гептапептид-нуклеотиду МсС.

2. Наличие аминопропильной группы в составе зрелого МсС приводит к увеличению антибактериальной активности соединения за счёт повышения сродства к белку-мишени - AspRS.

3. MccE является частью системы, обеспечивающей устойчивость клеток к МсС. С-концевой домен этого белка является ацетилтрансферазой, которая переносит ацетильную группу на процессированный МсС, и такая модифицированная форма антибиотика не ингибирует AspRS. Ацетилтрансферазная активность МссЕ не важна для синтеза антибиотика.

4. АВС-транспортёр YejABEF - это единственный комплекс белков внутренней мембраны E.

coli, ответственный за транспорт МсС через цитоплазматическую мембрану в цитоплазму клетки. Мутации в каждом из генов оперона yejABEF приводят к устойчивости к МсС.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в научных журналах:

1. Metlitskaya, A., Kazakov T., Vondenhoff G. H., Novikova M., Shashkov A., Zatsepin T., Semenova E., Zaitseva N., Ramensky V., Van Aerschot A., and Severinov K. 2009. Maturation of Translation Inhibitor Microcin C. J Bacteriol. 191: 2380-7.

2. Kazakov, T., Vondenhoff G.H., Datsenko K.A., Novikova M., Metlitskaya A., Wanner B.L., Severinov K. 2008. Escherichia coli peptidase A, B, or N can process translation inhibitor microcin C. J Bacteriol. 190: 2607-10.

3. Novikova, M., Metlitskaya A., Datsenko K., Kazakov T., Kazakov A., Wanner B., Severinov K.

2007. The Escherichia coli Yej Transporter Is Required for the Uptake of Translation Inhibitor Microcin C. J Bacteriol. 189: 8361- 8365.

Тезисы конференций:

1. Novikova, M., Metlitskaya A. Z., Kazakov, T. S., Datsenko K., Vondenhoff G.H., Severinov K.

Microcin C: biosynthesis, transport, processing of the translation inhibitor. 3rd Congress of European Microbiologists: «Microbes and Man – interdependence and future challenges», Gothenburg, Sweden, June 28 - July 2, 2009.

2. Новикова М. В., Метлицкая А. З., Казаков Т. С., Vondenhoff G. H., Северинов К. В.

Разработка нанолекарств на основе антибактериального пептида микроцина С. IV Российский симпозиум «Белки и пептиды», Казань, Россия, 23 – 27 июня 2009.

3. Novikova, M., Metlitskaya A. Z., Kazakov, T. S., Vondenhoff G.H., Severinov K. Dissecting the functions of the products of microcin C biosynthetic operon. VIII European Symposium of The Protein Society, Zurich, Switzerland June 14-18, 2009.

4. Novikova, M., Metlitskaya A. Z., Kazakov, T. S., Vondenhoff G.H., Severinov K. Microcin C:

transport, biosynthesis and mechanism of action. FEBS Practical Course on Protein interaction modules, Split, Croatia, April 18 - 25, 2009.

5. Новикова М. В., Метлицкая А. З., Казаков Т. С., Vondenhoff G. H., Северинов К. В.

Микроцин С: биосинтез, транспорт и механизм действия. «IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов», Новосибирск, Россия, 11 – 15 мая, 2008.

6. Novikova, M., Metlitskaya A., Datsenko K., Kazakov T., Kazakov A., Severinov K. The Escherichia coli ABC Transporter Yej Is Required for the Uptake of Antibiotic Microcin C.

2008. ATP-Binding Cassette (ABC) Proteins: From Multidrug Resistance to Genetic Diseases, Innsbruck, Austria, March 1-8, 2008.

Pages:     | 1 | 2 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»