WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

2. Ацетилтрансферазная активность MccEСTD обеспечивает устойчивость клеток к МсС и аналогам процессированного МсС Продукты микроцинового оперона mccABCDE не только обеспечивают синтез МсС, но и отвечают за резистентность клетки-продуцента к нарабатываемому антибиотику. Считается, что MccC - это помпа, находящаяся в цитоплазматической мембране E. coli, которая экспортирует зрелый антибиотик из клетки в окружающую среду. Вторым белком, который обеспечивает «иммунитет» клетки-продуцента к антибиотику, считался продукт mccE.

К моменту начала экспериментов по изучению роли MccE в «иммунитете» к МсС было показано, что в экстракте, содержащем все продукты микроцинового оперона, имеется активность, нейтрализующая ингибирование AspRS процессированным МсС. Нами было предположено, что MccE участвует в этом процессе.

Клетки, продуцирующие MccE и MccECTD, устойчивы к МсС и аналогам его процессированной формы. Из результатов биоинформатического анализа следует, что MccE – это двудоменный белок. N-концевой домен MccE - MccENTD - имеет гомологию с декарбоксилазами, С–концевой домен – MccECTD - гомологичен ацетил-KoА-зависимой ацетилтрансферазе RimL, которая осуществляет ацетилирование рибосомного белка L12.

В настоящей работе были получены экспрессионные плазмиды (на основе вектора pET28), содержащие ген mccE и отдельно его N-концевой и C-концевой домены – pET-mccE, pETmccENTD и pET-mccECTD. Были подобраны условия экспрессии рекомбинантных белков. Для получения MccE и его доменов в растворимом состоянии в клетки E. coli BL21(DE3) была введена дополнительная плазмида pG-KJE8 (dnaK-dnaJ-grgE, groES-groEL (Takara BIO Inc., Roush, R. F., E. M. Nolan, F. Lhr, and C. T. Walsh. 2008. Maturation of an Escherichia coli ribosomal peptide antibiotic by ATP-consuming N-P bond formation in microcin C7. J Am Chem Soc. 130:3603-3609.

Japan)), содержащая несколько генов, кодирующих шапероны. Использование шаперонов - белков, которые обеспечивают правильное сворачивание полипептидных цепей, - является одним из известных способов получения белков в растворимой форме.

Для проверки устойчивости McC наносили на мягкий агар с газоном тестируемой культуры и после роста клеток в течение нескольких часов измеряли диаметр образующихся зон ингибирования роста. Кроме МсС, дополнительно была проанализирована устойчивость клеток к тетрациклину (Tc), канамицину (Km) и хлорамфениколу (Сm) (pET28 содержит ген устойчивости к Km, а pG-KJE8 - к Cm). Из полученных результатов (Рис. 5) видно, что клетки, в которых происходит продукция MccE и MccECTD устойчивы к действию МсС. Клетки, продуцирующие MccENTD, чувствительны к антибиотику. Продукция MccE и его двух доменов не оказывает влияние на устойчивость к Tc. Все тестируемые культуры были устойчивы к Кm и Cm (данные не показаны).

Рисунок 5. Проверка устойчивости клеток, продуцирующих MccE и его домены, к МсС и аналогам процессированного МсС. В качестве контроля использовались клетки, содержащие вектор без вставки. На газон тестируемых культур было нанесено 5 мкл McC (300 мкM), мкл AspSA (6 мM), 5 мкл LeuSA (3 мM).

Для того чтобы выяснить, способен ли MccE обеспечивать устойчивость к процессированному МсС, мы использовали его синтетический аналог – аспартилсульфамоиладенозин (AspSA), а также другой аналог процессированного МсС – лейцилсульфамоиладенозин (LeuSA) (Рис. 1г) (получить процессированный МсС в количествах, необходимых для исследований, на данный момент невозможно). В системе in vitro AspSA и LeuSA ингибируют соответствующие аминоацил-тРНК-синтетазы с константами ингибирования – 8,0 nM и 8,4 nM, соответственно. Концентрация этих соединений, необходимая для Van de Vijver, P, G. H. Vondenhoff, T. S. Kazakov, E. Semenova, K. Kuznedelov, A. Metlitskaya, A. Van Aerschot, and K. Severinov. 2009. Synthetic Microcin C Analogs Targeting Different Aminoacyl-tRNA Synthetases. J Bacteriol. Accepted for publication.

ингибирования роста бактериальных клеток in vivo, составляет около 0,5 - 5 мМ (в зависимости от штамма).

Проверка устойчивости клеток, продуцирующих MccE, MccENTD и MccECTD, к аналогам процессированного МсС проводилась аналогично проверке на действие МсС. Оказалось, что клетки, продуцирующие MccENTD, так же, как и клетки, содержащие вектор без вставки, чувствительны к используемым концентрациям AspSA и LeuSA. Клетки, продуцирующие MccE, были устойчивы к АspSA, но частично устойчивы к LeuSA, в то время как продукция MccENTD приводит к полной устойчивости клеток к этим соединениям (Рис. 5).

Таким образом, MccECTD, по-видимому, обеспечивает устойчивость к МсС, функционируя на уровне процессированной формы антибиотика. Кроме того, действие MccE, вероятно, не зависит от аминокислотного остатка в структурах негидролизуемых аминоациладенилатов.

MccECTD обладает ацетилтрансферазной активностью. На основании гомологии MccECTD с RimL было сделано предположение, что MccECTD обладает ацетилтрансферазной активностью, и эта активность необходима для нейтрализации ингибирующего действия процессированного МсС. Мы проверили наличие ацетилтрансферазной активности у С-концевого домена MccE в системе in vitro. В качестве донора ацетильной группы использовали ацетил-KoA (AцKoA), в качестве возможных субстратов – AspSA, LeuSA, McC1178, McC1149, а также GluSA (глутамилсульфамоиладенозин (Рис. 1г), который является ингибитором глутамиловой тРНКсинтетазы (константа ингибирования 2,8 nM ), но в концентрации 5-10 мМ не подавляет рост клеток in vivo) и свободные аминокислоты – Asp, Leu и Glu. На основании данных колорометрического метода, в основе которого лежит определение количества свободного KоА, образующегося в ходе реакции, были посчитаны скорости ацетилирования белком тестируемых соединений. Оказалось, что MccECTD ацетилирует аналоги процессированного МсС (максимальная скорость реакции ацетилирования AspSA – 19,8 ± 0,9 мин-1; LeuSA – 47,3 ± 3,мин-1; GluSA – 40,0 ± 3,2 мин-1), а зрелый МсС, McC1149 и свободные аминокислоты не являются субстратами фермента.

Для локализации сайта ацетилирования аналогов процессированного МсС белком MccE продукты реакции были проанализированы методами гидрофильной HILIC-хроматографии (Hydrophilic interaction liquid chromatography) и тандемной масс-спектрометрии в лаборатории А.

Van Aerschot (Rega Institute for Medical Research, Бельгия). Оказалось, что все три соединения – ацетилированные AspSA, LeuSA и GluSA - имели ацетильную группу, которая располагалась на -аминогруппе аминокислотного остатка.

Van de Vijver, P, G. H. Vondenhoff, T. S. Kazakov, E. Semenova, K. Kuznedelov, A. Metlitskaya, A. Van Aerschot, and K. Severinov. 2009. Synthetic Microcin C Analogs Targeting Different Aminoacyl-tRNA Synthetases. J Bacteriol. Accepted for publication.

Для доказательства того, что ацетилтрансферазная активность MccECTD необходима для обеспечения устойчивости к МсС методом сайт-направленного мутагенеза был получен MccECTDмут - MccECTD, несущий двойную замену остатков Ser553 и Glu572 на остатки Ala (на основании данных по структуре активного сайта RimL предполагалось, что эти аминокислоты являются ключевыми остатками активного сайта MccE). Было показано, что максимальные скорости ацетилирования AspSA, LeuSA и GluSA мутантным белком составляют, соответственно, 0,8 ± 0,1 мин-1, 2,4 ± 0,3 мин-1 и 4,0 ± 0,5 мин-1, что в 10-25 раз ниже скорости реакции, катализируемой белком дикого типа. Кроме того, клетки, продуцирующие мутантную форму MccECTD, чувствительны к МсС и его процессированным аналогам (Рис. 5).

Для того чтобы определить, необходима ли ацетилтрансферазная активность MccECTD для синтеза антибиотика, мутации, приводящие к заменам Ser553 и Glu572 на остатки Ala, также были введены в последовательность гена mccE в составе полного микроцинового оперона.

Анализ антибиотика выделенного из культуры клеток pepApepBpepN, содержащих полученную плазмиду, показал, что основным продуктом синтеза является зрелый МсС. Таким образом, ацетилтрансферазная активность MccECTD необходима для обеспечения устойчивости клеток к МсС, но не играет роли в созревании МсС. По-видимому, в синтезе антибиотика участвует Nконцевой домен белка, гомологичный декарбоксилазам.

Ацетилированные аналоги процессированного МсС не ингибируют реакцию аминоацилирования in vitro. На основании полученных данных мы предположили, что устойчивость клеток-продуцентов к МсС обусловлена тем, что ацетилированный аналог процессированного МсС - ацетил-AspSA - не ингибирует AspRS, а устойчивость к аналогам процессированного МсС связана с тем, что продукты ацетилирования – ацетил-LeuSA и ацетилGluSA - не ингибируют соответствующие аминоацил-тРНК-синтетазы.

Ацетилированные AspSA, LeuSA и GluSA были проверены на способность ингибировать реакцию аминоацилирования in vitro. Из результатов (Рис. 6) видно, что добавление в экстракт клеток немодифицированых ингибиторов или аминоацилсульфамоиладенозинов, проинкубированных с MccENTD, подавляет реакцию аминоацилирования соответствующих тРНК, в то время как продукты, образующиеся в ходе ацетилтрансферазной реакции в присутствии MccECTD, – ацетилированные LeuSA, AspSA и GluSA - не влияют на активность тРНК-синтетаз.

Таким образом, ацетилированные аналоги процессированного МсС не ингибируют тРНКсинтетазы.

Рисунок 6. Реакция аминоацилирования в присутствии XSA (AspSA, LeuSA или Glu-SA) и ацетилированных XSA. Продукты реакции ацетилирования белком MccEСTD (XSA+АцKoA+MccECTD) добавлялись к S30 экстрактам E. coli. После чего к экстрактам были добавлены радиоактивные аминокислоты, соответствующие аминокислотным частям ингибиторов, а затем определялось количество аминоацилированной т-РНК по включению радиоактивно меченой аминокислоты (аспартата, лейцина или глутамата) во фракцию осадка, нерастворимого в холодной ТХУ. Для проверки были взяты XSA, а также эти же соединения, которые инкубировались с MccENTD (XSA+АцКoA+MccENTD). За 100% было принято количество аминоацил-тРНК, образуемое в отсутствии инкубации с каким-либо из соединений (контроль).

На основании результатов наших экспериментов, выполненных с использованием AspSA - аналога процессированного МсС, можно заключить, что С-концевой домен МссE является ацетилтрансферазой, которая переносит ацетильную группу на NH2–группу остатка Asp процессированного МсС, и что ацетилированная форма антибиотика не ингибирует клеточную мишень - AspRS. Мутации, приводящие к снижению ацетилтранcферазной активности MccE, приводят к чувствительности клеток к антибиотику.

3. Cистема транспорта МсС Механизм действия МсС предполагает, что появление устойчивости к антибиотику может быть обусловлено тремя типами мутаций - нарушениями транспорта МсС, его процессинга, а также повреждениями гена, кодирующего фермент-мишень.

Поскольку AspRS - жизненно важный фермент, то мутации в гене, кодирующем мишень, скорее всего, будут для клетки летальными. Однако не исключено, что мутации в регуляторной последовательности этого гена, например, повышающие его экспрессию, могут повлиять на уровень устойчивости. Действительно, было показано, что сверхпродукция AspRS приводит к устойчивости клеток к действию МсС 5.

Получение мутаций устойчивости, связанных с нарушением процессинга МсС маловероятно, так как в деградации пептидной части молекулы участвуют несколько взаимозаменяемых клеточных пептидаз. Было обнаружено, что клетки, лишённые одновременно трёх генов, кодирующих пептидазы широкой специфичности PepA, PepB и PepN, устойчивы к антибиотику.

Наконец, устойчивость к McC может возникать вследствие нарушения проникновения его в клетку. В предварительных исследованиях, проведенных в лаборатории И. А. Хмель, была проверена коллекция штаммов E. coli с мутациями различных компонентов транспортных систем. Было показано, что, одним из белков, участвующим в транспорте МсС в периплазму, является OmpF, так как клетки, несущие мутацию в этом гене, были частично устойчивы к антибиотику. Однако вопрос о системе, необходимой для транспорта антибиотика в цитоплазму, оставался неисследованным.

Для идентификации системы транспорта МсС была использована библиотека клеток E.

coli SG289, несущих случайные инсерции транспозона TNSC189 7, - SG289(Tn) (была любезно предоставлена Sean Garrity (Harvard Medical School, США)). Инсерция транспозона делает клетки SG289(Tn) устойчивыми к канамицину (Km).

Отбор клеток E. coli, устойчивых к McС, и проверка сцепленности устойчивости к Km и МсС. Из библиотеки клеток SG289(Tn) были отобраны 7 независимых колоний, устойчивых к МсС. Для экспериментального доказательства того, что устойчивость к МсС отобранных колоний действительно вызвана инсерцией транспозона, были проведены опыты по трансдукции фагом Р1vir. Для каждого из 7 штаммов было получено 10-20 колоний-трансдуктантов, устойчивых к Кm. Наличие инсерции транспозона у полученных трансдуктантов TnSC289 было подтверждено методом ПЦР. Все трансдуктанты были устойчивы к МсС (ко-трансдукция – 100%). Таким образом, можно заключить, что устойчивость к МсС у исследуемых колоний, действительно, обусловлена вставкой транспозона.

Определение нуклеотидной последовательности в районе вставки транспозона. Одним из ключевых моментов данной работы части было определение генов, в последовательность Metlitskaya, A., Kazakov T., Kommer A., Pavlova O., Praetorius-Ibba M., Ibba M., Krasheninnikov I., Kolb V., Khmel I., and Severinov K. 2006. Aspartyl-tRNA Synthetase is the target of peptide nucleotide antibiotic microcin C. J. Biol. Chem. 281: 18033-18042.

Khmel, I. A., V. M. Bondarenko, I. M. Manokhina, E. I. Basyuk, A. Z. Metlitskaya, V. A. Lipasova, and Y. M.

Romanova. 1993. Isolation and characterization of Escherichia coli strains producing microcins of B and C types.

FEMS Microbiol Lett. 111: 269-74.

Chiang S.L. & Rubin E.J. 2002. Construction of a mariner-based transposon for epitope-tagging and genomic targeting. Gene 296: 179-185.

которых произошла инсерция транспозона. Определение локализации транспозона проводили с помощью метода ПЦР с одним праймером в реакционной смеси и со сменой температур отжига праймера в течение опыта8. Было установлено, что у пяти трансдуктантов вставка транспозона произошла в различные места гена yejA, а у двух трансдуктантов 1 и 6 - в ген yejB. Оба этих гена находятся в составе оперона yejАBEF. На основании данных биоинформатического анализа можно утверждать, что гены оперона yejABEF кодируют белки олигопептидного транспортёра ABC-семейства: продукт гена yejА - это периплазматический белок, отвечающий за связывание субстрата, YejB и YejE – трансмембранные белки, а YejF - белок, обладающий АТФ-азной активностью. Данных о специфичности транспортной системы YejABEF не имеется.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»